復合微生物對四環(huán)素脅迫下多花黑麥草苗期生長和生理特性的影響

張 琛，李昌寧，姚 拓*，何 禮，陳 鑫，張 瀾，席博愛

(1.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

全球約40%～90%的抗生素通過家畜排泄物(尿液或糞便)進入土壤及水體，殘留的抗生素通過富集作用對土壤質量、生物多樣性及人類健康造成潛在威脅，解決獸用抗生素在土壤及水體中的殘留是當前環(huán)境保護領域的難題[1]。

抗生素的生物降解主要包括植物降解、微生物降解及“植物-微生物”協同降解[2-3]。植物對抗生素的降解方式包括植物根系直接吸收抗生素并將其轉化為無毒代謝產物，以及根系分泌物和相關酶類對抗生素的降解[4]。已有學者發(fā)現黑麥草具有降解土壤中多種抗生素的能力，其中對四環(huán)素的降解率為31.3%，并且種植黑麥草可緩解四環(huán)素對土壤微生物的抑制作用[5]。微生物降解抗生素是通過改變抗生素的結構和理化性質，將大分子的化合物進行分解，最終生成CO2和H2O[6]。許多微生物如假單胞菌、赭桿菌及枯草芽胞桿菌等均具有抗生素降解能力[7-9]?！爸参?微生物”耦合修復是一種綜合生物修復方法，能夠最大限度地提高抗生素降解率。植物在受到抗生素污染時，根際微微生物可以促進根部對抗生素的降解，而不能夠被降解的抗生素會在植物體內累積，最終達到降低污染物毒性，修復環(huán)境的目的[10]。張欣陽等[11]將四環(huán)素高效降解菌株接種到水生植物鳳眼蓮根際，發(fā)現接種菌株能夠提升鳳眼蓮對四環(huán)素的降解效率，證明了“植物-微生物”耦合對環(huán)境中殘留抗生素的降解起到了促進作用。

多花黑麥草(Loliummultiflorum)又稱一年生黑麥草，具有根系發(fā)達、生物量大、抗脅迫和適應性廣等優(yōu)點，被認為是良好的污染物修復物種之一。目前抗生素的生物降解主要集中在單一菌株或復合菌劑方面，對于“黑麥草-菌劑”進行四環(huán)素降解的研究從未見報道?；诖耍狙芯恳远嗷ê邴湶菁八沫h(huán)素降解菌系為材料，研究“黑麥草-復合菌劑”耦合對不同濃度四環(huán)素的降解效果，探索四環(huán)素殘留對黑麥草根系形態(tài)及生理生化指標的影響，以期為植物-微生物耦合降解四環(huán)素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養(yǎng)

供試多花黑麥草(Loliummultiflorum)種子購于百綠國際草業(yè)有限公司(中國，天津)，品種為‘特高’。供試微生物為復合菌系，菌株為試驗前期從穩(wěn)定降解四環(huán)素菌群中分離出的X8,J3[12]，二者以1∶2體積比例混合，制備為復合菌劑MI。

1.2 試驗設計與處理

選取黑麥草中籽粒飽滿、大小均勻的種子30粒，種子消毒處理后均勻點于培養(yǎng)皿中于室溫條件下進行萌發(fā)。1周后將材料分為兩部分，一部分制作為根尖石蠟切片，具體操作為用刀片切取黑麥草1 cm根尖，在FAA固定液中固定24 h后，用70%無水乙醇沖洗并脫水，以二甲苯：無水乙醇=1:1溶液處理1 h后浸蠟包埋，使用萊卡切片機(RM2235)縱向切片后使用番紅固綠染色并封片，通過光學顯微鏡觀察根尖細胞形態(tài)[13]。另一部分進行水培用于研究四環(huán)素殘留對黑麥草生長特性的研究，具體操作為選取長勢均一的幼苗移入水培箱中，水培箱置于人工氣候室中，溫度25℃，濕度45%，光照強度2 000lx，16 h/8 h光/暗交替培養(yǎng)。各處理如表1所示，每個處理6重復。在培養(yǎng)過程中先利用霍格蘭營養(yǎng)液將其培養(yǎng)至三葉一心后再進行處理，抗生素處理組分別添加50，100和150 mg·L-1四環(huán)素溶液；四環(huán)素降解菌系處理組在抗生素處理的基礎上添加四環(huán)素降解菌系2.0%(以菌系和培養(yǎng)基體積比為基數)，連續(xù)培養(yǎng)35 d后對不同處理間的材料分別取樣并測定相應的指標。

表1 不同濃度四環(huán)素及菌劑對黑麥草的處理

1.3 測定指標與方法

1.3.1黑麥草根長和苗長的測定 測量黑麥草根長苗長，苗長為從莖頂端生長點到根莖的距離[14]。

1.3.2黑麥草葉綠素含量的測定 黑麥草葉綠素含量測定采用比色法[15]：

Ca=13.95 A665-6.88 A649

Cb=24.96 A649-7.32 A665

Cx.c=(1 000 A470-2.05 Ca-114.8 Cb)/245

Ca+b=6.1 A665+20.04 A649

式中Ca，Cb，Cx.c，Ca+b分別為葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及總葉綠素濃度(mg·L-1)。求得色素的濃度后，計算組織中單位鮮重的各色素的含量：

葉綠體色素的含量 =(色素濃度×提取液體積)/樣品鮮重

1.3.3黑麥草細胞膜透性的測定 采用電導率法測定黑麥草幼苗的相對電導率[16]。

取大小相當的植物葉片0.1 g，6次重復，洗掙后用去離子水沖洗3次，用濾紙吸干表面的水分。將葉片剪成適宜長度，分別置于10 mL去離子水的試管中，蓋上蓋子后置于室溫下浸泡24 h。用電導儀(DDS-11A型)測定浸提液電導R1，然后對其進行沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫，搖勾，再次測定浸提液電導R2，無離子水電導率為R0。根據以下公式計算黑麥草葉片相對電導率：

1.3.4黑麥草生物量的測定 用分析天平稱量幼苗地上部和地下部鮮重，然后105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱量地上部和地下部干重[14]。

1.3.5黑麥草根系性狀的測定 以清水沖洗幼苗根部獲得完整根系，使用Scan-Makeri800Plus掃描儀(MICROTEK，中國)和LA-S植物根系分析儀對其進行掃描及分析，獲得3項根系相關指標數據：總根長、總根面積和總根體積[17]。

1.3.6黑麥草抗氧化酶活性的測定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)活性的測定采用試劑盒測定(蘇州夢犀生物醫(yī)藥有限公司)。

1.4 數據處理

本研究采用R軟件(Version 3.6.1)對同一四環(huán)素濃度(50，100，150 mg·L-1)處理的黑麥草生長及生理指標進行T檢驗(Student′s t test)，對不同濃度之間進行單因素方差(One-way ANOVA)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 四環(huán)素脅迫下菌劑對多花黑麥草幼苗根尖結構、根長和芽長的影響

通過四環(huán)素(50，100，150 mg·L-1)處理黑麥草種子(圖1A、B、C)，發(fā)現四環(huán)素處理下黑麥草根長苗長均受到了抑制，抑制程度表現為150 mg·L-1>100 mg·L-1>50 mg·L-1。添加菌劑能夠減弱四環(huán)素對黑麥草根長和苗長的抑制作用。為了明晰四環(huán)素脅迫下菌劑對抑制作用的緩解效果，篩選出100 mg·L-1四環(huán)素及100 mg·L-1四環(huán)素+MI處理進行石蠟切片，觀察四環(huán)素對根尖細胞生長的影響。

對100 mg·L-1四環(huán)素處理下的黑麥草幼苗根尖部位進行石蠟切片，發(fā)現對照組黑麥草根冠輪廓趨近于不規(guī)則的鈍化圓弧，不能形成完整帽狀覆蓋根尖；分生區(qū)部分細胞漲破；頂端分生組織細胞排列混亂(圖1D)。添加菌劑后根尖整體外觀增粗且細胞組織界線更加清晰(圖1E)，其中根冠部位細胞增多，形態(tài)恢復為正常的錐形圓弧；根尖邊緣的細胞排列緊密規(guī)則；頂端分生組織細胞排列規(guī)則且徑向層數較多，呈向下生長的趨勢。整體根尖細胞的數量和形態(tài)均得到了改善。

圖1 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草生長的影響

本試驗發(fā)現添加菌劑能夠緩解四環(huán)素對黑麥草根長芽長的抑制作用(圖2)。四環(huán)素濃度為50 mg·L-1時，處理組MI的根長與CK相比增加了34.32%，芽長增加了17.08%。添加濃度為100 mg·L-1和150 mg·L-1時，MI處理下的根長與對照相比分別增加了23.92%和28.04%，芽長分別增加了21.83%和19.19%。

圖2 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草根長和芽長的影響

2.2 四環(huán)素脅迫下菌劑對多花黑麥草色素含量和細胞通透性的影響

本研究分析了不同四環(huán)素脅迫下菌劑MI對黑麥草色素含量和細胞通透性的影響(圖3)，發(fā)現在四環(huán)素濃度分別為100 mg·L-1和150 mg·L-1時(圖3A)，MI處理下的葉綠素a含量顯著高于對照，增加量分別為27.90%(P<0.05)和81.63%(P<0.001)；在50 mg·L-1時葉綠素a的含量增加但不顯著。四環(huán)素濃度為50 mg·L-1及150 mg·L-1時(圖3B)，菌劑MI可使葉綠素b含量極顯著高于對照(P<0.001)，分別增加了28.08%,55.26%；在100 mg·L-1時增加了57.75%。在四環(huán)素濃度為50 mg·L-1和150 mg·L-1時，MI可使類胡蘿卜素的含量顯著高于對照(P<0.05)，與對照組相比分別增加了22.63%，20.83%(圖3C)；100 mg·L-1時MI處理下的類胡蘿卜素含量極顯著高于對照，增加了25.15%(P<0.01)。在四環(huán)素濃度為50 mg·L-1和100 mg·L-1時，MI處理可使總葉綠素含量顯著高于對照處理(P<0.05)，與對照組相比分別增加了9.11%,29.46%(圖3D)；在四環(huán)素濃度為150 mg·L-1時，MI可使總葉綠素含量極顯著高于對照(P<0.001)，增加了73.32%。此外，本研究探究了四環(huán)素脅迫下添加菌劑MI對黑麥草細胞通透性的影響(圖3E)，其中四環(huán)素濃度為50,100和150 mg·L-1時，MI處理下的黑麥草相對電導率均表現為顯著降低(P<0.05)，與對照組相比分別降低了34.34%,13.67%,11.94%；而未經四環(huán)素處理的相對電導率降低量不顯著，與對照相比降低了22.69%。

圖3 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草色素含量和細胞通透性(相對電導率)的影響

2.3 四環(huán)素脅迫下菌劑對多花黑麥草生物量和根系性狀的影響

本研究發(fā)現在四環(huán)素脅迫下黑麥草的株高和根長生長均受到抑制(圖4A)。經MI處理后，0，50和150 mg·L-1濃度下的株高顯著增加(P<0.05)，與對照相比分別增加了19.77%，15.71%和32.03%；100 mg·L-1濃度下株高增加但不顯著，與對照相比增加了13.63%。添加菌劑后0 mg·L-1和150 mg·L-1濃度下黑麥草根長顯著增加(P<0.05)，與對照相比分別增加了30.1%和46.46%，100 mg·L-1濃度下根長增加但差異不顯著。

隨著四環(huán)素濃度的增加，添加菌劑可使黑麥草地上鮮重與對照相比分別增加11.22%，21.60%和1.78%(圖4B)，并且添加菌劑能顯著促進100 mg·L-1的地上干重和150 mg·L-1及地下干重(圖4C)。

本研究發(fā)現，隨著四環(huán)素脅迫濃度梯度的增加，黑麥草根系體積，根系直徑、根系表面積及總根長均受到抑制作用，但添加菌劑對黑麥草根系受到的四環(huán)素脅迫作用有所緩解(圖4D,E,F)。添加菌劑后，黑麥草根體積及根直徑均顯著大于對照(P<0.05)，根體積的變化范圍為2.61%～31.24%。添加菌劑后，四環(huán)素脅迫下的黑麥草根表面積顯著高于對照組(P<0.05)，與對照相比根表面積的變化范圍為12.21%～19.53%。總根長與對照相比均有增加，其中濃度為50 mg·L-1和150 mg·L-1時菌劑處理下的黑麥草總根長顯著高于對照組(P<0.05)，分別提高了19.00%和27.24%。

圖4 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草生物量和根系性狀的影響

2.4 四環(huán)素脅迫下菌劑對多花黑麥草丙二醛和抗氧化酶活性的影響

本研究測定了四環(huán)素處理下菌劑對黑麥草抗氧化酶活性的影響(圖5)。當四環(huán)素濃度為0 mg·L-1時(霍格蘭營養(yǎng)液)，添加菌劑對黑麥草MDA含量沒有顯著影響(圖5A)；隨著四環(huán)素濃度的增加(50～150 mg·L-1)，MDA含量顯著增加，添加菌劑能顯著降低黑麥草MDA含量(11.86%～25.29%)，其中四環(huán)素濃度為150 mg·L-1時，添加菌劑后MDA與對照相比下降25.29%(P<0.01)。當四環(huán)素濃度為0 mg·L-1時，添加菌劑對SOD活性沒有顯著影響(圖5B)；黑麥草SOD的活性在四環(huán)素濃度為50 mg·L-1和100 mg·L-1時表現為升高，添加菌劑可使SOD活性升高2.75%和0.80%，而在150 mg·L-1濃度時降低6.36%(P<0.05)。POD的含量在四環(huán)素濃度為0 mg L-1時，添加菌劑對POD活性沒有顯著影響(圖5C)；隨著四環(huán)素濃度的增加(50 mg·L-1～150 mg·L-1)，POD活性呈現增加趨勢(12.68%～49.12%)，當四環(huán)素濃度為50 mg·L-1～150 mg·L-1時，添加菌劑可使黑麥草POD活性分別增加49.12%(P<0.05)和12.68%(P<0.01)。在四環(huán)素濃度為0 mg·L-1時，添加菌劑對CAT活性沒有顯著影響(圖5D)；當四環(huán)素濃度為50 mg·L-1和150 mg·L-1時，添加菌劑可使黑麥草CAT活性升高51.53%和30.08%(P<0.05)，但在四環(huán)素濃度為100 mg·L-1時，添加菌劑可降低CAT活性24.78%(P<0.05)。

圖5 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草丙二醛和抗氧化酶活性的影響

3 討論

3.1 四環(huán)素脅迫下菌劑對多花黑麥草幼苗根尖結構、根長和芽長的影響

本試驗發(fā)現在四環(huán)素的作用下黑麥草根長芽長減小，添加菌劑能夠減弱四環(huán)素對黑麥草根長芽長的抑制作用。根長芽長受到抑制的原因可能是四環(huán)素阻礙了根尖細胞的有絲分裂及根部的養(yǎng)分吸收，進而使地上部分的發(fā)育受到阻礙[18]。添加菌劑后黑麥草根長芽長增大，這一現象在50 mg·L-1濃度下最為明顯，原因可能是菌劑MI中的假單胞菌X8及耶氏酵母菌J3對四環(huán)素起到了降解作用，并對黑麥草起到了促生作用。黑麥草根系可能為微生物的繁殖提了良好的生存環(huán)境，提升了微生物的呼吸強度[19]。

通過電子顯微鏡對黑麥草根尖縱切進行觀察發(fā)現，100 mg·L-1四環(huán)素處理下黑麥草根尖細胞損傷嚴重，添加菌劑能夠減弱四環(huán)素對根尖細胞形變和生長抑制的作用?？股氐任镔|的脅迫能夠抑制植物根尖細胞的分裂和伸長，并對細胞造成遺傳損傷[20-21]。四環(huán)素使黑麥草細胞壁疏松和使細胞膨脹，并使根尖內部組織界限模糊，這與植株發(fā)芽時根部顏色變淺，質地細軟相對應。添加菌劑使黑麥草根尖細胞狀態(tài)恢復，表現為細胞間隙減小、細胞排列整齊且大小均一、頂端分生組織區(qū)域分界清晰。根尖細胞形態(tài)恢復的原因一方面可能是菌劑促進了黑麥草根尖細胞分裂素的產生，使細胞數量趨于正常；另一方面黑麥草在微生物強化下對四環(huán)素起到了降解作用，減少了四環(huán)素含量，緩和了根尖細胞受到的毒性損傷。

3.2 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草色素含量和細胞通透性的影響

葉綠素作為植物體內最重要的色素之一，是評價非生物脅迫毒性對植物影響的重要參數[22]。本試驗發(fā)現添加菌劑顯著增加了四環(huán)素脅迫下黑麥草葉綠素含量。四環(huán)素能夠對葉綠體基因表達以及葉綠素合成酶的活性產生抑制，造成葉綠素降解及光合色素代謝紊亂[23-24]。添加菌劑提高了黑麥草葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量，原因可能是黑麥草的根系分泌物有利于菌群的繁殖，菌群在適宜條件下對四環(huán)素進行降解，使黑麥草的毒性物質吸收量減少，植株葉綠體功能趨于正常。

植物受環(huán)境脅迫程度可由細胞膜的損傷程度表示，相對電導率是反應細胞膜脂過氧化的重要指標[25-26]。本試驗中，四環(huán)素脅迫誘導黑麥草產生過多活性氧，造成植物質膜受損、細胞通透性增大、電解質外滲，添加菌劑能夠減弱四環(huán)素脅迫對黑麥草細胞膜造成的影響。已有研究表明，四環(huán)素對植物細胞膜及線粒體膜造成氧化損傷，而加快葡萄糖的代謝可緩解氧化損傷[27]。添加菌劑降低黑麥草相對電導率的原因一方面可能是菌劑對四環(huán)素進行了降解，減弱了四環(huán)素對黑麥草細胞膜的毒性，另一方面可能是菌劑分泌的代謝物促進了黑麥草體內葡萄糖的氧化分解，緩解了因四環(huán)素脅迫造成的氧化應激，降低了細胞活性氧水平，維持了細胞膜穩(wěn)定性。

3.3 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草生物量和根系性狀的影響

本試驗中，添加菌劑能夠減弱四環(huán)素脅迫對黑麥草株高根長的抑制作用，且添加菌劑能夠增加四環(huán)素脅迫下黑麥草鮮干重。四環(huán)素脅迫使黑麥草生物量減少，尤其是地上干重受到的影響較為嚴重，原因可能是四環(huán)素影響了黑麥草的凈光合速率，導致其有機物積累的減少，脫水后干重降低。研究表明，抗生素脅迫能夠阻礙細胞分裂素的產生，抑制番茄、黃瓜、苜蓿等作物的生物量[28-29]。添加菌劑顯著增加四環(huán)素脅迫下黑麥草的株高根長及生物量，這可能是由于菌劑對四環(huán)素進行了降解，菌劑分泌的代謝物可能對有機物的累積起到了積極作用。研究發(fā)現，加入一株放線菌Act12后，Pb脅迫下黑麥草根的分蘗及根鮮重顯著增加，說明微生物能促進黑麥草根的發(fā)育[30]。微生物可能產生了有機酸、酶、氨基酸等代謝產物，調節(jié)了植株根域微生態(tài)環(huán)境，刺激植物根系進行養(yǎng)分吸收。

植物根系特性是判斷植物自身生長的重要指標[31]。本試驗中，添加菌劑使四環(huán)素脅迫下黑麥草根系性狀恢復，表現為總根長、根體積、根直徑、根表面積的提高。四環(huán)素能夠通過調節(jié)丙氨酸代謝、氮代謝等途徑來影響黑麥草根系的正常生長[13]。添加菌劑可能對黑麥草生理代謝具有積極作用，促進了葡萄糖、半乳糖等物質的合成，提升了根尖中生長素的產生及運輸速率。黑麥草產生根系分泌物可能為菌群所利用，刺激了微生物呼吸作用，使其對營養(yǎng)物質的利用率增大，加快繁殖，最終表現為降解四環(huán)素能力的增強。

3.4 四環(huán)素脅迫下菌劑對黑麥草丙二醛和抗氧化酶活性的影響

植物細胞內葉綠體和線粒體是產生活性氧的重要部位，活性氧的累積會引起植株體內MDA及抗氧化酶活性的變化[32]。本試驗中，添加菌劑降低了四環(huán)素脅迫下黑麥草MDA含量，增加了50 mg·L-1和100 mg·L-1四環(huán)素脅迫下黑麥草抗氧化酶SOD、POD含量及50 mg·L-1下CAT的含量?；钚匝醯睦鄯e導致細胞產生膜脂過氧化，MDA作為膜脂過氧化產物，其含量越高表示植物受到的氧化損傷越嚴重。研究發(fā)現，添加菌株能夠使非生物脅迫下植物MDA含量明顯降低[33]。本試驗中，菌劑減緩了四環(huán)素對黑麥草造成的膜脂過氧化，一方面可能是微生物增強了黑麥草根系抗氧化系統(tǒng)，提高了黑麥草對過多活性氧的清除能力，降低了細胞氧化損傷；另一方面可能是微生物及黑麥草對四環(huán)素起到了降解作用，減少了四環(huán)素在生長環(huán)境中的含量，降低了其對抗氧化系統(tǒng)的抑制作用。

植物能夠通過提高抗氧化酶活性來清除因脅迫產生的過量活性氧，其中SOD能夠清除超氧陰離子，減少自由基對植物造成的傷害；POD可以調節(jié)植物對病原體和創(chuàng)傷的反應，并清除植物體內過多的酚類物質；CAT能夠作用于H2O2并將其歧化分解為H2O和O2，減少細胞受到的氧化損傷[34-36]。添加菌劑使黑麥草抗氧化酶含量上升，說明菌劑對四環(huán)素脅迫下黑麥草抗氧化系統(tǒng)起到了保護作用。研究發(fā)現，在非生物脅迫下添加微生物能夠誘導植物抗氧化酶活性的增加，減輕細胞膜損傷程度[37-39]。黑麥草抗氧化酶含量提高的原因可能是菌劑對四環(huán)素進行了降解，提高了黑麥草對四環(huán)素脅迫的耐受性，增強了黑麥草抗氧化酶系統(tǒng)；菌劑分泌物可能調節(jié)了黑麥草細胞滲透勢，穩(wěn)定了細胞結構及酶類的合成，緩解了四環(huán)素對植物造成的氧化損傷。

4 結論

本文以四環(huán)素脅迫下多花黑麥草為材料，發(fā)現四環(huán)素脅迫可使多花黑麥草根尖細胞形態(tài)發(fā)生改變，主要表現為根冠區(qū)、根尖邊緣及內部出現潰爛，菌劑可使根尖整體外觀增粗，整體根尖細胞的數量和形態(tài)均得到改善。菌劑能夠顯著增加黑麥草色素含量(葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素)，促進根體積、根直徑、根表面積、總根長和株高的增加，增加地上和地下生物量，降低相對電導率及MDA含量，提升抗氧化酶SOD,POD活性。