基于CRISPR/Cas9技術建立IGF2R基因修飾PK-15細胞

謝春嫡，郭肖蓉，2，張煦棟，3，周榮*，李奎

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室，廣東佛山 528225；3.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010010；4.中國農業(yè)科學院深圳農業(yè)基因組研究所，深圳 518120）

我國是畜禽消費大國，畜禽養(yǎng)殖也是我國重要的經濟產業(yè)。藏豬是我國優(yōu)秀的高原品種，其耐粗飼、抗高寒環(huán)境、抗逆性強以及皮薄肉好的特質是其他豬種所不及的[1-2]，解析藏豬抗逆性強，肉質好的原因有助于培育畜禽新品種，從而促進我國畜牧業(yè)的發(fā)展。藏豬也能作為良好的研究模型，但是目前對藏豬或者其他優(yōu)秀高原畜禽種質的研究都很少，這就限制了畜禽品種向抗逆方向的改良。

胰島素樣生長因子家族是一類多功能細胞增殖調控因子,主要包括胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）、胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、胰島素 樣生長因子2受體（IGF2R）以及多種胰島素樣生長因子結合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs），這些因子在細胞分化、增殖及胚胎、個體生長發(fā)育中具有重要的作用。IGF2R 是一種單鏈跨膜糖蛋白，分胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內區(qū)，其中胞外區(qū)最大，由15 個相鄰的單元組成，每個單元都含有8 個位置高度相似的半胱氨酸殘基。IGF2R有兩種配體結合位點：一種是位于結構域3和結構域9 的甘露糖6-磷酸結合位點（mannose 6-phosphate，M6P）；另一種是位于結構域11 的IGF2 的結合位點[3]，結構域5 有1 個位點與結構域3、9 以及陽 離子依 賴性的M6P受體（cation dependent M6P receptor，CD-M6PR）結合位點有顯著的同源性，但是結合配體的能力不如M6P 和IGF2 位點[4]。IGF2R 的M6P 位點與溶酶體分選相關功能有關，IGF2 位點與生長功能相關，雖然這兩個位點并不在同一位置，但是會互相競爭抑制[5]。最新的研究表明，Caspase 9 非凋亡活性會影響IGF2R 的逆行轉運，進而影響溶酶體分選過程[6]。IGF2 結合IGF2R 后激活糖原合成激酶3α∕β（glycogen synthase kinase 3α∕β，GSK3α∕β）從而促進甲基轉移酶3A(DNA-methyltransferase 3α，Dnmt3A)介導的DNA 甲基化，隨后影響液泡型H+-ATP 酶（vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase）的表達，最終導致質子重新傳導到線粒體膜間隙，并引起持續(xù)的氧化磷酸化[7],說明IGF2R 可能與線粒體某些功能有關。

亞洲豬和歐洲豬種在基因組上存在許多大的結構變異（structural variations，SVs），并且這些SVs比單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)對基因表達的影響更大[8]。本實驗室前期研究亞洲豬的基因組[9]發(fā)現(xiàn)，與國外豬相比，中國藏豬的IGF2R基因在其36內含子上有1段274 bp的缺失，并通過PCR 和實時定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）驗證了這段缺失對IGF2R基因表達的影響?；贗GF2R基因功能和前期基礎，推測藏豬IGF2R基因內含子上的缺失可能與其低氧耐受的特性有關，本研究利用基因編輯技術制備了IGF2R基因第36內含子上的大片段缺失，并對基因編輯細胞進行了初步研究，以期解析該片段的功能，進一步研究該基因對藏豬抗逆性能的影響，這對品種改良和育種有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細胞和載體

PK-15 細胞購自北京中原合聚經貿有限公司，pX458-GFP[10]是實驗室前期保存的質粒載體，感受態(tài)細胞采購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

細胞用DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，12800082）、FBS（ExCell，F(xiàn)SP500）、Pen-strep（YEASEN，60162ES76）、胰酶（Gibco，25200072）培養(yǎng)；電轉化用Cell Line Nucleofector Kit V 轉染試劑盒（Lonza，VCA-1003）；質粒用北京康為世紀無內毒素質粒中提試劑盒提?。–WBIO，CW2105S）；用高保真酶進行PCR（Vazyme，P515），CCK-8 試劑（Vazyme，A311）檢測細 胞活力，ECL 發(fā)光液（Vazyme，E411）、RNA 提取用TRIZOL（Vazyme，R401）、反轉錄（Vazyme，R312）及熒光定量PCR（Vazyme，Q711）試劑均購自南京諾唯贊生物科技股份 有限公 司。IGF2R抗體（Abmart，T55516）、Actin（Abmart，M20011）、GAPDH（Abmart，M20050）、Caspase9（Abmart，T55049）、BAX（Abmart，T40051）、二抗（Abmart，M21003）均購自艾比瑪特公司。

1.3 IGF2R基因修飾載體構建

在IGF2R基因第36 個內含子處按照18-20N+NGG 規(guī)律選擇sgRNA 打靶序列，設計2條引物：sgRNA1和sgRNA2（表1）。將合成的2對寡聚核苷酸（oligo3nucleotide，oligo）退火后分別連接到線性化質粒上得到重組質粒[11]，分別命名為pX458-GFP-IGF2R1和pX458-GFP-IGF2R2，同 時由北京擎科生物科技有限公司從頭合成IGF2R基因274 bp修飾的同源序列。

1.4 細胞培養(yǎng)

細胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度在90%左右時使用胰酶將其消化下來傳代或者凍存。傳代將細胞按所需比例傳到相應培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細胞凍存時按基礎培養(yǎng)基∶血清∶DMSO=7∶2∶1 的比例配制好凍存液，細胞消化離心后用凍存液將細胞吹散轉移到凍存管中，在4 ℃中放置10 min，再轉移到-20℃冰箱放置20 min，隨后放到-80 ℃過夜，盡快將細胞轉移到液氮中保存。

1.5 細胞轉染

當細胞密度達到90%時將其消化離心，按照Cell Line Nucleofector Kit V 轉染試劑盒說明進行細胞轉染，轉染10 h后更換培養(yǎng)液，48 h內進行流式細胞分選。

1.6 重組質粒突變效率檢測

轉染后的細胞使用流式細胞術進行富集，收集產生明顯熒光的細胞1 萬顆，隨后與空白細胞一起提取DNA。PCR 后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，分析經重組質粒切割后產生的突變條帶的灰度值，確定重組質粒的突變效率。所用的引物如表1 所示。

1.7 單克隆細胞的培養(yǎng)及基因型鑒定

流式分選后的細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)每3 d 換1 次，7 d 后在徠卡顯微鏡（DMI6000 B）明場下觀察每個孔是否長出細胞，并及時傳代。當傳到24 孔培養(yǎng)板時，取少量細胞（100μL 體積細胞液）提 取DNA進行PCR，反應體 系：2 × Phanta Max Master Mix 10μL，上、下游引物（表1）各0.5μL，無菌水8 μL，DNA 1 μL。反應程序：95℃3 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 CCK-8實驗

挑選出的單克隆細胞與野生型細胞以2 000 孔-1的數(shù)量鋪入96 孔細胞培養(yǎng)板中，每24 h加入CCK-8 試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，使用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度，分別檢測24、48、72、96 h細胞吸光度，計算細胞活力。

1.9 RT-qPCR

將細胞鋪到12 孔板中，48 h 后收取細胞，用傳統(tǒng)氯仿法提取RNA，再將RNA 反轉錄成cDNA作為熒光定量的模板，按照諾唯贊熒光定量試劑盒說明書進行操作。

1.10 Western-blot

細胞用蛋白裂解液提取總蛋白后使用5×Loading buffer變性（100 ℃，10 min），經電泳（120 V，15 min；200 V，45 min）后轉膜（200 mA，2 h），再將轉完膜后的PVDF 膜放入5%的脫脂奶粉中，在室溫搖床上孵育1 h，按照抗體說明書稀釋后將含有目的條帶的膜放入抗體稀釋液中，4 ℃搖床中孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBS with Tween-20，TBST）洗3 次后進行二抗孵育，室溫搖床孵育40 min，最后使用ECL 發(fā)光顯色液進行顯色。

1.11 免疫熒光

24孔盤中的細胞用4%多聚甲醛固定30 min,透膜液通透20 min 后經5%奶粉封閉1 h，一抗孵育2 h，二抗孵育40 min，2 ug∕mL DAPI 復染5 min后用熒光顯微鏡拍照用于后續(xù)統(tǒng)計。

1.12 數(shù)據(jù)分析

采用Image J 軟件分析凝膠電泳條帶灰度值并計算敲除效率；RT-qPCR 以及CCK-8 結果使用GraphPad prism 8.0分析。

2 結果與分析

2.1 重組質粒突變效率檢測

基因缺失的目的序列在野生型PK-15 細胞基因組上存在，而在基因修飾后的細胞基因組上缺失。將構建好的pX458-GFP-IGF2R1和pX458-GFP-IGF2R2質粒轉染到細胞中，24 h 后在熒光顯微鏡下能看到綠色熒光（圖1A 和B），說明重組質粒已成功轉染進細胞。PCR擴增后凝膠電泳結果顯示(圖1C)，野生型細胞只有1條帶（593 bp），而經2 個重組質粒切割后的細胞產生了2 條帶（593、450 bp），說明本實驗中構建的重組質粒能對目的序列進行有效切割。Image J分析電泳條帶灰度值后發(fā)現(xiàn)切割效率為30%。

圖1 質粒構建及效率檢測Fig.1 Plasmid construction and efficiency detection

2.2 單克隆細胞基因型分析

共挑出了418 株細胞，提取DNA 后進行PCR擴增并測序驗證。其中共鑒定到雙等位基因修飾細胞株37 個，效率為8.85%。流式分選圖如圖2A所示，方框圈出部分為發(fā)綠色熒光并進行流式分選的細胞，這部分細胞占所有細胞的5.15%，重組質粒轉染效率較低。圖2B展示了部分細胞株PCR鑒定結果，產生了不同基因型的細胞，說明編輯有效。

圖2 單克隆細胞基因型分析Fig.2 Genotype analysis of monoclonal cells

2.3 IGF2R基因修飾細胞特征分析

利用RT-qPCR、蛋白免疫印跡技術和免疫熒光技術對挑選出的野生型細胞以及雙等位基因修飾細胞進行mRNA 和蛋白水平上的分子特征鑒定。結果顯示，與野生型細胞（WT）相比，IGF2R雙等位基因修飾細胞（IGF2R-∕-）mRNA 表達極顯著下調（P＜0.01）（圖3B），并且蛋白表達水平也顯著下調（P＜0.05）（圖3A和C）。

圖3 IGF2R基因修飾細胞分子特征鑒定Fig.3 Molecular characterization of the IGF2R gene deletion cell

2.4 IGF2R基因修飾對細胞活力的影響

為了探究IGF2R基因的修飾對細胞活力的影響，利用CCK-8 實驗檢測IGF2R基因修飾細胞與野生型細胞的活力差異。結果（圖4）顯示，IGF2R基因274 bp修飾細胞的活力在72 h時極顯著高于WT 組（P＜0.01），說明IGF2R基因修飾細胞的狀態(tài)良好。

圖4 IGF2R基因的修飾對細胞活力的影響Fig.4 Effect of IGF2R gene deletion on cell viability

2.5 IGF2R基因修飾對細胞凋亡的影響

抑制凋亡基因BCL-2mRNA 水平極顯著上升（P＜0.05），但BAX基因mRNA 水平無顯著變化（圖5A），說明IGF2R基因的修飾抑制了細胞的凋亡。利用Western-blot 檢測了IGF2R基因修飾對細胞凋亡的影響，結果（圖5B）發(fā)現(xiàn)，與野生型細胞相比，IGF2R基因修飾細胞促凋亡蛋白Caspase9和BAX水平顯著下調（P＜0.05），抑制凋亡基因蛋白BCL-2水平無顯著變化。

圖5 IGF2R基因的修飾對細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of IGF2R gene deletion on apoptosis

3 討論

CRISPR-Cas9 基因編輯工具是一項突破性的技術，可以精確地引起目標基因組上的突變，并且速度快、成本低，這加速了動物模型的建立，提高了研究效率[12]。目前已經通過建立動物疾病模型來研究人類疾病，證明基因治療是可行的[13-14]，這是基因編輯技術的一大應用。我國是畜禽消費大國，豬在畜禽消費中占了舉足輕重的地位，但是近幾年因為非洲豬瘟以及其他豬流行性疾病導致生豬資源大幅度減少，市場上豬肉價格大幅度上升，這不僅擾亂了市場經濟，更是對我國豬業(yè)的重創(chuàng)，影響豬業(yè)發(fā)展。但是目前的技術難以解決畜禽疾病帶來的危害或者進行品種改良，CRISPR-Cas9技術是解決這些問題的新手段。目前，詹群美等[15]已通過CRISPR-Cas9 技術制備了肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)基因編輯巴馬香豬，顯著提高了巴馬香豬的瘦肉率。在研究豬疾病方面，姜元[16]將CRISPR-Cas9 和RNAi 技術相結合，制備出了抗豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的豬；本團隊前期通過CRISPR-Cas9制備出了同時抗豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎病毒、豬德爾塔冠狀病毒等3 種重大疫病的基因豬[17]，最近建立了一種高效的基因編輯技術[18]，該技術無需進行單克隆細胞分選并且不引入質粒DNA，提高了基因編輯動物制備效率。

Igf2r基因缺陷會引起胎兒過度增長，甚至在圍產期死亡[19-21]。在畜禽育種中，IGF2R作為重要經濟性狀的候選基因被廣泛研究，有報道指出IGF2R影響鴨脂肪的形成[22]；埃及水牛IGF2R基因單核苷酸突變會引起犢牛日增重增加，這種變化可能是通過IGF2的表達增加實現(xiàn)的[23]。本研究通過CCK-8 和RT-qPCR、Westernblot 發(fā)現(xiàn)，IGF2R基因修飾細胞株在培養(yǎng)72 h 時活力顯著升高，凋亡蛋白表達降低，抑制凋亡基因的mRNA 水平上升，可能是因為IGF2R表達的降低減少了負性生長因子（transforming growth factor β1，TGFβ1）的活性，使細胞繼續(xù)增殖。在多個研究中都發(fā)現(xiàn)IGF2R基因與腫瘤相關[24-25]，劉世博等[26]發(fā)現(xiàn)沉默IGF2R基因可以促進腫瘤細胞的增殖。IGF2基因能促進由IGF1R缺乏所導致的心肌細胞的凋亡，并且這種凋亡是線粒體依賴性的，抑制IGF2R的表達可以阻斷由IGF2誘導的心肌細胞的凋亡[27]，這些結果都表明IGF2R基因與細胞增殖有關。

IGF2R基因對細胞和個體的生長、增殖、凋亡有重要影響，本實驗通過基因編輯技術對IGF2R基因進行了精準修飾，這對后續(xù)研究其功能有重要作用。本研究還成功構建了IGF2R基因精確修飾的PK-15細胞系，并初步進行了功能研究，為研究IGF2R基因功能提供細胞模型，并為后續(xù)基因編輯豬的制備奠定基礎。