翟文婭，李博，王濟秀，王煥嶺，劉紅

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室/長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cyto?kine signaling，SOCS）家族成員是重要的細(xì)胞因子受體信號反饋抑制因子[1］，可以通過對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的信號通路進(jìn)行負(fù)調(diào)控從而防止過多的信號干擾免疫系統(tǒng)發(fā)育及其功能調(diào)控[2］。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白（cytokine-inducible SRC homology 2 do?main protein，CISH）在1995 年被發(fā)現(xiàn)，它是SOCS 家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員[3］；隨后在1997 年，人們發(fā)現(xiàn)了SOCS1[4］；至今，人們在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)了8個SOCS 家族成員，分別為SOCS1~SOCS7 與CISH[5］；在魚類中，還發(fā)現(xiàn)了SOCS3b、SOCS5b、SOCS8以及SOCS9[6-7］等魚類特有的成員。

目前，在哺乳動物中對SOCS 家族基因功能已有深入研究，已有大量研究探究了SOCS 家族基因的主要功能[8-10］。但是在魚類中，有關(guān)SOCS 家族基因的研究有限，目前僅在半滑舌鰨（Cynoglossus semi?laevis）[11］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[12］、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[13］等部分水產(chǎn)動物中驗證了其在免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

團頭魴（Megalobrama amblycephala）屬鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鲌亞科（Culteri?nae）、魴屬（Megalobrama），因其具有肉質(zhì)較嫩、個體規(guī)格適于中國家庭消費、生長速度較快、易于養(yǎng)殖且養(yǎng)殖成本不高等優(yōu)點而備受廣大養(yǎng)殖戶的青睞。但是近年來，不合理的養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)和布局及濫用藥物等，嚴(yán)重阻礙了其養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。其中由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）引發(fā)的細(xì)菌性敗血癥每年都會導(dǎo)致大量的團頭魴死亡，造成巨大經(jīng)濟損失。團頭魴抗嗜水氣單胞菌感染的相關(guān)基因的研究已有很多[14-16］，本研究一方面通過對團頭魴SOCS 家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析來確定其分子特征；另一方面探究SOCS 家族基因在健康團頭魴各組織與嗜水氣單胞菌感染后的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探究團頭魴SOCS 家族在抵抗嗜水氣單胞菌感染中發(fā)揮的免疫功能提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用團頭魴均采集于湖北省洪湖市洪湖水產(chǎn)魚種養(yǎng)殖場，幼魚體質(zhì)量為（50±10）g，成魚體質(zhì)量為（500±20）g。將試驗魚轉(zhuǎn)移到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實驗基地中暫養(yǎng)，水溫為25~28 ℃，24 h 不間斷充氧，早晚各換水1 次，換水量為總體積的1/4，暫養(yǎng)14 d后開始試驗。

1.2 團頭魴SOCS的生物信息學(xué)分析

首先檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得團頭魴socs1、socs3a、socs3b基因（GenBank 登錄號：MK101316.1，MH107241.1，MH107242.1）與斑馬魚（Danio rerio）socs2、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9基因（登錄號：NM_001114550.1，NM_001111225.1，NM_001113758.2，NM_001113797.1，EF195764.1，NM_001287077.1，NM_001113801.1）的cDNA 序列，并利用斑馬魚socs基因的cDNA 序列通過本地Blast 從團頭魴轉(zhuǎn)錄組（登錄號：PRJ?NA716731）中獲取對應(yīng)的團頭魴序列。

通 過ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orf?finder）預(yù)測10個團頭魴socs基因的ORF 及氨基酸序列；利 用ExPASy（http：//web. expasy. org/com?pute_pi/）預(yù)測其蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量（MWs）與理論等電點（pI）；使用SMART（http：//smart.embl.de/）預(yù)測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并使用IBS 1.0.3 進(jìn)行繪圖；從GenBank 數(shù)據(jù)庫獲取斑馬魚、青鳉（Oryzias latipes）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）等脊椎動物物種已有的SOCS蛋白序列，利用MEGA 6使用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ法）構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3 試驗樣品采集

為了確定團頭魴socs基因的組織表達(dá)模式，分別取3 尾健康團頭魴成魚的心臟、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、腦、血液、腸道、肌肉和鰓10個組織（器官）。

為了探究嗜水氣單胞菌感染后團頭魴socs基因的組織表達(dá)模式，以團頭魴幼魚為試驗對象，隨機設(shè)置對照組與感染組2 個處理組，每一處理設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)（每個生物學(xué)重復(fù)取3尾魚）。感染試驗中，對感染組團頭魴每尾腹腔注射0.1 mL 濃度為6.7×106CFU/mL 的嗜水氣單胞菌，對照組腹腔注射等量PBS 緩沖液。在注射后的0、4、12、24、72 h 分別采集感染組和對照組的脾臟、體腎和頭腎組織[17］。

上述樣品快速分離后置于液氮中，凍存24 h 后轉(zhuǎn)入?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取及cDNA合成

組織總RNA 提取采用Trizol 法，具體步驟參照Trizol試劑（Invitrogen）說明書。提取的RNA 濃度通過紫外分光光度計（Nanodrop 2000，美國）進(jìn)行測定，RNA 的完整度與純度通過瓊脂糖凝膠電泳法測定。使用PrimeScript?RT reagent Kit（TaKaRa，日本）試劑盒按照說明書對提取的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA保存于?20 ℃冰箱。

1.5 半定量PCR及熒光定量PCR（qRT-PCR）

通過半定量PCR 方法檢測socs基因在健康團頭魴不同組織的表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系為10.0 μL，包括cDNA 模板1.0 μL、ddH2O 7.1 μL、10×TaqPCR Buffer 1.0 μL、上下游引物各0.3 μL、dNTP 0.15 μL、TaqDNA 酶0.15 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。擴增后，取5.5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖膠電泳檢測。

通過熒光定量PCR（qRT-PCR）評估團頭魴SOCS家族基因在嗜水氣單胞菌刺激后脾臟、體腎與頭腎中的表達(dá)。qRT-PCR反應(yīng)總體系為20.0 μL，包括SYBR 混合試劑10.0 μL、ddH2O 7.4 μL、cDNA 模板1.0 μL、上下游引物各0.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min 后，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸15 s，進(jìn)行40個循環(huán)。

選擇18S rRNA為內(nèi)參基因，使用primer pre?mier 5.0 軟件對團頭魴socs設(shè)計特異性上下游引物（表1），并由武漢擎科生物科技有限公司合成。

表1 本研究用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 數(shù)據(jù)處理

基因的表達(dá)量采用2?ΔΔCt法計算，使用SPSS Statistics 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan’s進(jìn)行多重比較，數(shù)值均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（mean±SE）表示，P<0.05 為統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P<0.01 為統(tǒng)計學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 團頭魴10個socs基因序列分析

通過本地Blast 比對NCBI 中獲得的斑馬魚SOCS 家族基因與檢索NCBI 中團頭魴SOCS 家族基 因，共 獲 得socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10 個團頭魴socs基因序列，分別編碼201、197、209、216、378、526、557、530、744、494 個氨基酸，等電點（pI）分布在5.69~9.37，平均等電點為7.85，蛋白分子質(zhì)量為22.3~80.97 ku，具體信息見表2。

表2 團頭魴SOCS家族基因特征Table 2 Features of SOCS family genes identified in M.amblycephala

預(yù)測團頭魴10 個socs基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1 所示：團頭魴SOCS 家族基因具有1~8 個外顯子，其中大部分socs基因僅具有1 個外顯子，但socs7具有7 個外顯子。對其蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖2 所示，顯示其均含有2 個保守結(jié)構(gòu)域，分別是SOCS BOX 特異性蛋白結(jié)構(gòu)域與SH2 中心結(jié)構(gòu)域。

圖1 團頭魴socs基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Gene structure of socs in M.amblycephala

圖2 團頭魴SOCS家族蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Protein domains of SOCS family in M.amblycephala

2.2 SOCS的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過MEGA構(gòu)建SOCS系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。團頭魴與草魚（Ctenopharyngodon idella）、斑馬魚親緣關(guān)系較近，然后與其他硬骨魚類聚為一支，與哺乳動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上的物種分類地位一致。進(jìn)化樹分為2 個主要分支：一支（Ⅰ型）包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7 與SOCS9，另一支（Ⅱ型）包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a與SOCS3b。

圖3 脊椎動物SOCS系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of SOCS in vertebrates

2.3 SOCS家族基因在健康團頭魴組織中的表達(dá)

半定量PCR 結(jié)果（圖4）顯示在健康團頭魴成魚中，socs1基因在腦組織中的表達(dá)量最高，其次在血液和心臟表達(dá)量較高，在腸、體腎、脾臟、頭腎組織中也有不同程度表達(dá)，在其余組織的表達(dá)量較低或未表達(dá)；socs2基因在體腎與血液中的表達(dá)量最高，其次為心臟、鰓、肝臟、脾臟與腸；socs3a基因在腦中的表達(dá)量最高，其次為血液和脾臟，在肝臟和體腎中也有一定程度的表達(dá)；socs3b、socs4、socs5a、socs5b基因在團頭魴各組織中表達(dá)量均不高；socs6與socs7在脾臟、體腎、頭腎、腦與血液中表達(dá)量均較高；socs9在脾臟中表達(dá)量最高，其次為心臟，在除肌肉與鰓以外的組織中也有一定量的表達(dá)?？傮w而言，10個團頭魴socs基因在體表組織（鰓、腸）表達(dá)量較低，在脾臟、體腎、腦與血液中表達(dá)量較高；團頭魴socs1、socs2、socs3a、socs6、socs7與socs9表達(dá)量相對其他4個基因較高。

圖4 SOCS家族基因在團頭魴不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expressions of 10 SOCS family genes in various tissues of M.amblycephala

2.4 嗜水氣單胞菌感染后SOCS家族基因的表達(dá)

通過qRT-PCR 結(jié)果可知，嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴脾臟中sosc5a、sosc5b、sosc6、sosc9表達(dá)量無明顯差異，sosc1、sosc3a、sosc3b表達(dá)量在嗜水氣單胞菌感染后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均在12 h達(dá)到峰值；sosc2、sosc7表達(dá)量在嗜水氣單胞菌感染后4 h 均出現(xiàn)顯著下調(diào)，sosc2表達(dá)量在12 h 出現(xiàn)短暫回升并于感染后24 h 再次顯著下調(diào)，sosc7表達(dá)量則是在24 h 出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)后于72 h 恢復(fù)至初始水平；sosc4表達(dá)量在嗜水氣單胞菌感染后先顯著下調(diào)后逐漸回升至初始水平（圖5A）。

嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴體腎中sosc4、sosc5b、sosc9表達(dá)量無明顯差異，sosc1、sosc3a、sosc3b表達(dá)量變化趨勢與脾臟中一致，其中sosc1與sosc3a在感染后12 h達(dá)到峰值，sosc3b在感染后24 h達(dá)到峰值；sosc6、sosc7表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；sosc2在4 h表達(dá)顯著上調(diào)，在12 h出現(xiàn)短暫回落并于感染后24 h 再次顯著上調(diào)，在72 h 恢復(fù)至初始水平；sosc5a表達(dá)量在在嗜水氣單胞菌感染后出現(xiàn)下調(diào)，24 h出現(xiàn)短暫輕微上調(diào)后再次下調(diào)（圖5B）。

嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴頭腎中sosc2、sosc5a表達(dá)量無明顯差異，sosc1、sosc3a、sosc3b、sosc6表達(dá)量仍呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，均在感染后12 h時達(dá)到峰值；sosc4、sosc5b、sosc9、sosc7表達(dá)量在嗜水氣單胞菌感染后出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，其中sosc4在感染后24 h出現(xiàn)短暫回升但未恢復(fù)至初始水平，72 h再次出現(xiàn)下調(diào)趨勢；sosc7在短暫下調(diào)后24 h 出現(xiàn)回升，72 h后恢復(fù)至初始水平（圖5C）。

圖5 嗜水氣單胞菌感染后SOCS家族基因在團頭魴脾臟（A）、體腎（B）和頭腎（C）中的表達(dá)量Fig.5 Relative expression of SOCS family gene in spleen（A），kidney（B）and head kidney（C）of M.amblycephala after infection by Aeromonas hydrophila

3 討 論

細(xì)胞因子具有多效性，它在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖以及受損組織修復(fù)等多個過程中發(fā)揮著重要作用[18］。SOCS 蛋白可通過多種機制減弱細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[13］。已有研究發(fā)現(xiàn)，SH2 中心結(jié)構(gòu)域可與N 區(qū)協(xié)同，通過結(jié)合特定細(xì)胞因子受體識別目標(biāo)蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19］，SOCS BOX 特異性蛋白結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合泛素蛋白對其降解。因此，在信號傳遞過程中，SOCS 蛋白主要是由SH2 中心結(jié)構(gòu)域特異性識別目標(biāo)蛋白后通過SOCS BOX 特異性蛋白結(jié)構(gòu)域使其降解。此外，在草魚、梭魚（Liza haematocheila）等魚類中，SOCS 家族基因蛋白具有高度保守的SH2 中心結(jié)構(gòu)域和SOCS BOX 特異性蛋白結(jié)構(gòu)域[20-21］，本研究中的團頭魴SOCS 蛋白均含有這2 個特征蛋白結(jié)構(gòu)域，此結(jié)果與已有研究相同，表明這10 個SOCS 蛋白結(jié)構(gòu)相對保守。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，10 個SOCS 可分為2 個亞族：Ⅰ型家族中包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7 與SOCS9，Ⅱ型家族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a 與SOCS3b，這與梭魚等物種中已有研究結(jié)果一致[21-22］。在果蠅中只存在Ⅰ型亞族的類似基因[23］，因此可推測在進(jìn)化過程中，Ⅱ型亞族成員可能是由Ⅰ型亞族成員基因復(fù)制產(chǎn)生，硬骨魚類中特有的幾種socs基因也表明類似的基因復(fù)制也發(fā)生在魚類進(jìn)化的過程中[18］。

健康團頭魴半定量PCR 結(jié)果顯示，socs1和socs9在心臟中表達(dá)量較高；socs3a、socs6與socs3b在肝臟中表達(dá)量較高，細(xì)胞因子在葡萄糖代謝、脂肪代謝以及蛋白質(zhì)代謝過程中均有參與，那么SOCS 作為細(xì)胞因子信號抑制蛋白的1種，在團頭魴重要代謝器官肝臟中具有高表達(dá)可能與此有一定關(guān)系。脾臟與體腎是魚體重要的免疫器官[24］，在本研究中，socs1、socs3a與socs9在脾臟中表達(dá)量較高，socs1與socs2在體腎中表達(dá)量較高，這表明其可能在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。在腦中，socs1和socs3a高表達(dá)，暗示其可能在血腦屏障的建立中起著一定作用[21］；socs2具有調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞分化的功能，同時也可以影響神經(jīng)元與中間神經(jīng)元間的信息傳遞[25］，符合其在腦中有一定表達(dá)量的研究結(jié)果；socs7基因缺失小鼠相較于野生型小鼠體質(zhì)量輕，同時約有50%的小鼠在出生后2 周頭蓋骨會出現(xiàn)畸形，大腦皮層變薄并最終死亡[10］，這意味著它在大腦發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，與其在腦中高表達(dá)結(jié)果相一致。

在魚類中，Poly（I：C）、LPS 和細(xì)菌已被證明能夠影響socs基因的表達(dá)[26-27］。本研究中，團頭魴在嗜水氣單胞菌感染后的4 h 內(nèi)，部分socs基因出現(xiàn)差異表達(dá)現(xiàn)象，表明在急性反應(yīng)期間SOCS 家族基因會發(fā)揮一定作用。在嗜水氣單胞菌感染后，socs2在頭腎中無顯著性變化，在脾臟中顯著下調(diào)，而在體腎中顯著上調(diào)，推測這與socs2在不同組織中發(fā)揮作用不同有關(guān)；socs1、socs3a與socs3b在團頭魴頭腎、脾臟、體腎中的總體變化趨勢相同，均為顯著上調(diào)。據(jù)報道，溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）后在3 個免疫組織（頭腎、肝臟、脾臟）中socs1、socs3的表達(dá)量均顯著升高[13］；愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染3 h 后，斑點叉尾鮰腸道中socs1表達(dá)量顯著上調(diào)；遲緩愛德華菌（Ed?wardsiella tarda）感染后，半滑舌鰨肝臟、體腎與脾臟中socs1表達(dá)量在所檢測時間點均出現(xiàn)顯著上調(diào)[11］，這些研究結(jié)果與本試驗研究結(jié)果均表明socs1、socs3a與socs3b在細(xì)菌感染后機體免疫過程中發(fā)揮了重要功能。socs4在感染后表達(dá)量小幅度降低但仍有統(tǒng)計學(xué)差異，這意味著其可能以低表達(dá)量協(xié)同參與調(diào)控過程。socs5a、socs5b表達(dá)量在感染前后幾乎無顯著差異，這暗示了它們可能不參與機體免疫防御過程。socs6在頭腎中表達(dá)量出現(xiàn)了顯著上調(diào)，socs7在3 個組織中同樣出現(xiàn)了顯著上調(diào)，這意味著其可能在抵抗嗜水氣單胞菌感染過程中也發(fā)揮了一定的功能。

綜上所述，本研究初步探究了團頭魴10 個SOCS分子特征，分析了其在健康團頭魴中的組織分布及嗜水氣單胞菌脅迫下的表達(dá)模式，可為進(jìn)一步研究團頭魴SOCS家族基因功能奠定基礎(chǔ)。