張愛,張君杰,高琳琳,袁亦彤,周華,王艷秋
(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腎臟內(nèi)科,沈陽(yáng) 110004;2.遼寧電力中心醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)保障部,沈陽(yáng) 110002;3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科,沈陽(yáng) 110024)
腎纖維化是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD)的共同特征,其機(jī)制復(fù)雜,包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖連蛋白和Ⅰ型膠原)產(chǎn)生及降解不平衡[1]、腎小管上皮細(xì)胞凋亡和萎縮、小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和分泌炎癥介質(zhì)[轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等]多個(gè)環(huán)節(jié)[2]。目前腎纖維化尚無(wú)有效治療方法,因此,探索新的有效干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)防和治療腎纖維化尤為重要。
已有研究顯示,二甲雙胍在癌癥和心血管疾?。?]、非酒精性脂肪性肝炎[4]的治療中也發(fā)揮重要作用。在小鼠模型中二甲雙胍可以通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路緩解葉酸誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化[5]。在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠模型中,二甲雙胍也能通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路減輕腎臟的纖維化[6]。
Hippo/YAP通路不但調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡,還在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控器官大小等方面發(fā)揮重要作用。正常機(jī)體內(nèi),處于活化狀態(tài)的Mst1/2能夠磷酸化并激活其底物L(fēng)ATs1/2,進(jìn)一步磷酸化其下游YAP,導(dǎo)致其無(wú)法入核,喪失轉(zhuǎn)錄輔助因子的功能。生理狀態(tài)下的Hippo/YAP通路能夠負(fù)調(diào)控其下游效應(yīng)分子YAP的轉(zhuǎn)錄活性,以限制組織過(guò)度生長(zhǎng),從而在維持細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。而在病理狀態(tài)下,YAP發(fā)生去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核與其下游靶蛋白TEAD結(jié)合,促進(jìn)Hippo/YAP通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。近年來(lái)Hippo/YAP通路的研究多集中于抗腫瘤領(lǐng)域[8]。近期研究[9]發(fā)現(xiàn)Hippo/YAP信號(hào)通路可能參與心血管疾病的血管重塑,與心血管疾病和腎臟疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。也有研究[10]提示Hippo/YAP信號(hào)通路可能參與缺血性急性腎損傷并促進(jìn)腎纖維化。本研究探討二甲雙胍對(duì)UUO誘導(dǎo)的小鼠腎臟纖維化的影響及其作用機(jī)制,旨在為腎臟疾病的治療提供新方案。
30只5~7月齡C57BL/6小鼠,體質(zhì)量20~25 g,SPF級(jí),購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020PS664K)。主要試劑包括二甲雙胍(美國(guó)Sigma公司),p-YAP(AP0489)、LATs1(A17992)、TEAD(武漢愛博泰克公司,A5218),YAP1(武漢賽維爾公司,GB11542),β-actin(武漢亞科因公司,A01011),F(xiàn)4/80(Sc-52664)、TGF-β1(美國(guó)Santa Cruz公司,Sc-1700),CD68(上海碧云天公司,AF6432)。
1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組:小鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、UUO組、二甲雙胍組,每組10只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)法[11]建立UUO小鼠模型,UUO組、二甲雙胍組小鼠5%異戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹部消毒、備皮,取左側(cè)腹部腎區(qū)切口進(jìn)入腹腔,游離左側(cè)輸尿管,在其上1/3處及腎門處以4-0手術(shù)線結(jié)扎。假手術(shù)組小鼠僅分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎。二甲雙胍組手術(shù)前1 d開始采用二甲雙胍灌胃[200 mg/(kg·d),溶劑為生理鹽水],連續(xù)7 d。UUO組和假手術(shù)組同時(shí)間給予等量生理鹽水灌胃。然后處死小鼠,膀胱穿刺收集尿樣,心臟穿刺留取血標(biāo)本。生理鹽水灌注腎臟后,留取腎上極并進(jìn)行石蠟固定,剩余腎組織及血、尿標(biāo)本于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。
1.2.2 血尿標(biāo)本檢測(cè):按試劑說(shuō)明書應(yīng)用比色法檢測(cè)尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG),肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血肌酐,脲酶法檢測(cè)尿素氮。
1.2.3 HE染色:腎臟組織石蠟切片(厚度4 μm)后HE染色,脫水封片,應(yīng)用正置顯微鏡觀察腎臟組織纖維化程度的變化。
1.2.4 Masson染色:腎臟組織石蠟切片(厚度4 μm),烤片,脫蠟水化,Masson染色封片。顯微鏡(200倍)觀察并拍照。腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分[12]:每張切片觀察20~30個(gè)視野并拍照,采用IPP軟件計(jì)算,纖維化程度評(píng)分=纖維化面積/總面積×100%。
1.2.5 免疫組化染色:腎臟石蠟切片(厚度4 μm),烤片、脫蠟,抗原修復(fù),加一抗4 ℃過(guò)夜。二抗37 ℃反應(yīng)45 min。DAB顯色劑,脫水,封片。200倍鏡下隨機(jī)選取5張圖像,使用 ImageJ 軟件測(cè)量并計(jì)算平均光密度。
1.2.6 免疫熒光染色:石蠟切片烤片、脫蠟,抗原修復(fù),BSA封閉,一抗4 ℃過(guò)夜。二抗室溫避光染色1 h。DAPI染核,封片,固定。200倍鏡下隨機(jī)選取5張圖像,使用 ImageJ 軟件測(cè)量并計(jì)算平均光密度。
1.2.7 Western blotting檢測(cè):提取腎臟組織蛋白,BCA法測(cè)定總蛋白濃度。SDS-PAGE膠制備、上樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗4 ℃過(guò)夜,二抗37 ℃ 60 min,ECL顯色。應(yīng)用ImageJ采集圖像,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值來(lái)進(jìn)行半定量分析。
結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO組尿NAG顯著升高(P< 0.05),提示UUO模型建模成功。與UUO組比較,二甲雙胍組尿NAG顯著降低(P< 0.05)。血尿素氮和血肌酐3組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P> 0.05),見表1。
表1 3組小鼠尿NAG、血尿素氮和血肌酐水平比較Tab.1 Comparison of urinary NAG,blood urea nitrogen,and serum creatinine levels among the three groups
HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常,無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。UUO組腎小管明顯擴(kuò)張,呈不規(guī)則狀,甚至融合成空洞,腎小管刷狀緣完整性被破壞;集合管、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀甚至消失;腎間質(zhì)有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織增生。與UUO組比較,二甲雙胍組腎間質(zhì)病變改善,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,見圖1。
Masson染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組藍(lán)色膠原沉積少,小管間質(zhì)范圍窄。UUO組大量膠原纖維沉積,間質(zhì)范圍增寬。而二甲雙胍組較UUO組膠原沉積減少。見圖1、表2。
圖1 3組小鼠腎臟病理HE和Masson染色結(jié)果×200Fig.1 HE staining and Masson staining of renal tissue in the three group ×200
免疫組化結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO組TGF-β1、CD68和YAP1表達(dá)顯著增加(均P< 0.05);與UUO組比較,二甲雙胍組TGF-β1、CD68和YAP1表達(dá)均明顯下降(均P< 0.05)。見圖2、表2。
圖2 3組TGF-β1、CD68和YAP1表達(dá)比較×200Fig.2 Comparison of TGF-β1,CD68,and YAP1 expression in renal tissues among the three groups using immunohistochemical staining ×200
免疫熒光染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO組F4/80表達(dá)明顯增加(P< 0.05);與UUO組比較,二甲雙胍組F4/80表達(dá)顯著降低(P< 0.05)。見表2、圖3。
圖3 3組免疫熒光染色結(jié)果×200Fig.3 Immunofluorescence staining of renal tissue among the three group ×200
表2 3組小鼠腎臟組織纖維化及TGF-β1、CD68、YAP1、F4/80表達(dá)比較(%)Tab.2 Comparison of renal fibrosis and the expression of TGF-β1,CD68,YAP1,and F4/80 among the three groups(%)
結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO組腎臟組織中YAP1及下游靶蛋白TEAD的表達(dá)水平顯著增加(均P< 0.05),p-YAP和YAP1上游負(fù)調(diào)控分子LATs1的表達(dá)水平顯著減少(均P< 0.05)。與UUO組比較,二甲雙胍組YAP1及TEAD表達(dá)水平下降,p-YAP、LATs1表達(dá)水平增加(均P< 0.05),見圖4。
圖4 3組小鼠腎臟組織中YAP1、p-YAP、LATs1、TEAD蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of YAP1,p-YAP,LATs1,and TEAD in renal tissues among the three groups
研究[13]顯示,正常腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷、纖維化的發(fā)生和發(fā)展是導(dǎo)致CKD的主要原因。在纖維化過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞被認(rèn)為是關(guān)鍵因素,而TGF-β尤為重要[14]。腎臟含有多種固有免疫細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞等),在維持組織穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用,一旦被激活,就會(huì)產(chǎn)生炎癥介質(zhì),引發(fā)腎臟疾?。?5]。有證據(jù)[16]表明腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)參與腎移植轉(zhuǎn)歸、腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮;而且其浸潤(rùn)水平和腎小球硬化、間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)[17]。
關(guān)于UUO小鼠模型和進(jìn)行性CKD患者的研究[18]顯示,骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞,并通過(guò)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(F4/80、CD68)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的共表達(dá)以及膠原蛋白的產(chǎn)生來(lái)鑒定。巨噬細(xì)胞的聚集和分化在腎損傷的各個(gè)階段都至關(guān)重要[19]。巨噬細(xì)胞的過(guò)度積累是誘導(dǎo)腎損傷發(fā)生的重要因素,去除巨噬細(xì)胞可減少腎臟組織中的巨噬細(xì)胞募集及巨噬細(xì)胞來(lái)源的炎性細(xì)胞因子,降低腎臟的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及腎纖維化過(guò)程,從而減少腎臟組織損傷[20]。
UUO模型是較成熟的研究腎小管間質(zhì)纖維化的模型。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO組尿NAG水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05);而血肌酐、血尿素氮3組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P> 0.05),考慮可能與小鼠造模時(shí)間短、腎小管間質(zhì)損傷時(shí)間短以及機(jī)體代償有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,與UUO組比較,二甲雙胍組TGF-β1、CD68、F4/80的表達(dá)顯著減少(均P< 0.05),推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)抑制單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)降低腎臟炎癥反應(yīng),從而進(jìn)一步抑制腎間質(zhì)纖維化。
Hippo/YAP信號(hào)通路作為一種進(jìn)化保守的通路,在從果蠅到人類的細(xì)胞增殖、凋亡和分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示,UUO模型能夠顯著上調(diào)腎組織中YAP、TEAD的表達(dá),并顯著下調(diào)其上游調(diào)控因子LATs和p-YAP的表達(dá),而二甲雙胍治療能夠逆轉(zhuǎn)上述變化,提示腎組織中YAP信號(hào)通路的激活可能參與腎纖維化。
本研究結(jié)果顯示,二甲雙胍治療能顯著降低UUO小鼠的腎間質(zhì)纖維化,而腎間質(zhì)纖維化是CKD的共同特征,是進(jìn)展為終末期腎病的病理基礎(chǔ)。因此推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)降低腎間質(zhì)纖維化參與改善CKD的病理過(guò)程。Hippo/YAP信號(hào)通路在UUO模型腎組織中能顯著激活,并能通過(guò)上調(diào)促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)水平促進(jìn)腎纖維化過(guò)程,通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞抗原CD68、F4/80,激活巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和炎癥反應(yīng),促進(jìn)腎纖維化,進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常。
綜上所述,二甲雙胍可能通過(guò)干預(yù)Hippo/YAP信號(hào)通路來(lái)改善UUO模型小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常。但本研究未獲得二甲雙胍通過(guò)抑制單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)降低腎臟炎癥反應(yīng)的直接證據(jù),因此結(jié)論有待進(jìn)一步研究論證。
中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2022年11期