胡潤鋒，李浚哲，李鵬飛，周軍，李湘洲*

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，長沙 410004；2.廣西民族大學(xué)，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，南寧 530006；3.廣西民族大學(xué)，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530006)

糖尿病是一種需要終身治療的慢性代謝疾病，有研究表明糖尿病為新型冠狀病毒肺炎的第二大并發(fā)癥，且糖尿病患者感染新冠的風(fēng)險更高，感染后病情更嚴重[1]。因此，在新冠肺炎疫情蔓延全球的當下，糖尿病的治療顯得尤為重要。α-葡萄糖苷酶可快速降解碳水化合物，導(dǎo)致血糖水平升高[2]。目前許多藥物都是通過抑制α-葡萄糖苷酶活性來實現(xiàn)降糖效果。然而這些藥物存在肝損傷、腸胃不適等副作用[3]，因此科研人員開始專注于從天然產(chǎn)物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，研究出新穎、安全、副作用少的治療藥物。

桑葉含有多種活性成分，如多糖、黃酮、甾體類、生物堿等[4]。多糖作為桑葉的主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等生物活性[5]。此外，有研究表明氧化應(yīng)激與糖尿病之間存在著密切的聯(lián)系[6]。因此，同時具有強抗氧化活性和降血糖活性的桑葉多糖有望成為糖尿病的首要候選藥物。近幾年，國內(nèi)外有諸多學(xué)者做過桑葉多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究，崔漢釗等[7]利用分級醇沉法得到不同的桑葉多糖組分，結(jié)果表明在低濃度醇沉得到的多糖組分對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出更好的抑制效果。羅晶潔等[8]從桑葉多糖中分離純化得到兩種不同多糖組分均對α-葡萄糖苷酶活性起到較好的抑制效果。

然而，目前國內(nèi)外的研究僅僅局限于桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果上，而對其抑制動力學(xué)和抑制類型方面卻鮮有報道。此外，多糖的組成、分子量、結(jié)構(gòu)對多糖的生物活性均有很大的影響?；诖?，筆者利用離子交換柱層析分離純化得到不同的多糖組分，并對不同多糖組分的結(jié)構(gòu)、分子量、單糖組成進行了探究，最后深入研究桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果、抑制動力學(xué)及其抑制類型。研究結(jié)果可為桑葉中多糖資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

干桑葉，產(chǎn)自湖南永州，采摘于2019年10月，常溫曬干；DEAE-52纖維素、葡聚糖系列(分子質(zhì)量為3 000～2×106u)、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖，上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，上海藍季生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葉多糖的提取

將桑葉粉碎后烘干，稱取一定量的桑葉粉，按照固液比1∶20(g∶mL)加入乙醇，80 ℃回流2 h后過濾，濾渣60 ℃烘干得到脫脂桑葉粉。稱取一定量脫脂桑葉粉，按照1∶20(g∶mL)的固液比加入去離子水，80 ℃回流提取2 h，離心取上清液。依次用聚酰胺樹脂和S-8大孔樹脂動態(tài)吸附法去除提取液中蛋白和色素，濃縮后加入4倍體積的乙醇，5 ℃下靜置24 h后過濾，沉淀依次分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，冷凍干燥得到桑葉多糖(MLP)并計算得率，見公式(1)。

多糖得率=(m1/m0)×100%

(1)

式中：m1為多糖質(zhì)量，g；m0為桑葉粉質(zhì)量，g。

1.2.2 DEAE-52纖維素柱層析

取一定量的MLP用蒸餾水復(fù)溶，用DEAE-52纖維素(40 cm×4 cm)柱層析，依次用0，0.1，0.3和0.5 mol/L的NaCl溶液洗脫，自動收集器收集，流速3.0 mL/min，每管5 mL。用苯酚-硫酸法跟蹤檢測各管吸光值，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線合并各組分并濃縮，用蒸餾水流動透析72 h(3 500 u)，冷凍干燥，將得到的產(chǎn)品分別命名為MLP-1、MLP-2、MLP-3、MLP-4，并用公式(1)計算得率。

1.2.3 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定桑葉多糖的糖含量[9]。以葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。配制一定質(zhì)量濃度的桑葉多糖溶液，按照上述方法測得吸光值代入標準曲線并計算糖含量。

1.2.4 桑葉多糖分子量的測定

采用凝膠色譜法(GPC)測定桑葉多糖的各組分的純度及其分子量[10](Agilent 1200)。色譜條件：SB-804HQ(8.0 mm×300 mm)柱，示差折光器，柱溫25 ℃，流動相為0.1 mol/L的NaCl溶液，流速0.6 mL/min，進樣20 μL。根據(jù)凝膠色譜圖上的峰面積和出峰數(shù)判斷多糖的純度，通過出峰時間計算多糖分子量。

1.2.5 桑葉多糖單糖組成的測定

采用氣相色譜法(GC)測定桑葉多糖的單糖組成[11](Agilent GC7890)。色譜條件：HP-5色譜柱，氮氣，F(xiàn)ID檢測器。升溫程序：初始溫度為160 ℃，保持3 min；3 ℃/min升至190 ℃；1 ℃/min升至200 ℃，保持2 min；2 ℃/min升至210 ℃，保持15 min；進樣口溫度250 ℃，分流比5∶1，進樣量1 μL；檢測器300 ℃。

對多糖進行水解和乙?；幚恚鶕?jù)保留時間和峰面積對多糖的水解產(chǎn)物進行定性與定量分析。

1.2.6 紅外光譜分析

利用KBr壓片法對多糖樣品進行壓片制樣，經(jīng)傅里葉變換紅外光譜儀(ALPHA II，布魯克公司)掃描，頻率64 Hz，32次，范圍400～4 000 cm-1。

1.2.7 桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用分析

采用PNPG法測定桑葉多糖抑制α-葡萄糖苷酶的活性[12]。向96孔板中依次加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PSB，pH為6.8)、樣品和0.4 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，置于酶標儀中37 ℃孵育10 min，之后加入5 mmol/L的PNPG溶液50 μL，37 ℃孵育45 min，再加入0.2 mol/L Na2CO3溶液50 μL以終止反應(yīng)，置于酶標儀(ThermoFisher Multiskan GO)405 nm下檢測吸光值，以阿卡波糖作為陽性對照。反應(yīng)體系見表1，對α-葡萄糖苷酶的抑制率計算方法見公式(2)。

表1 反應(yīng)體系Table 1 Reaction system 單位：μL

(2)

式中：A1、A2、A3、A4分別為按照反應(yīng)體系表1反應(yīng)后得到的吸光度值。

1.2.8 桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制類型分析

根據(jù)參考文獻[13]的方法并稍微改變：固定底物濃度為5 mmol/L，分別設(shè)置不同濃度的酶溶液(0.05，0.10，0.20，0.40和0.60 U/mL)和樣品溶液(0，0.01，0.05和0.10 mg/mL)，按照表1的反應(yīng)體系進行試驗，反應(yīng)過程中讀數(shù)間隔30 s/次。以反應(yīng)初速度V0為縱坐標，酶濃度E為橫坐標繪制點圖并線性擬合，根據(jù)擬合直線的相交和平行情況及直線的斜率變化情況，探究桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶抑制的可逆性。

1.2.9 桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)分析

根據(jù)參考文獻[13]的方法并稍微改變：固定酶濃度為0.4 U/mL，分別設(shè)置不同濃度的底物溶液(0.25，0.50，1.00，3.00和5.00 mmol/L)和樣品溶液(0，0.01，0.05和0.10 mg/mL)，按照表1的反應(yīng)體系進行試驗，反應(yīng)過程中讀數(shù)間隔30 s/次。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖法，以反應(yīng)初速度的倒數(shù)1/V0對底物濃度的倒數(shù)1/S繪制點圖并線性擬合，由縱軸截距可計算出最大反應(yīng)速率Vm的值，再根據(jù)米氏方程計算出米氏常數(shù)Km，由Km和Vm的變化趨勢確定酪氨酸酶的抑制類型。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用3次獨立重復(fù)試驗結(jié)果的平均值±標準差表示，采用Origin 9.1繪圖。采用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉多糖的提取分離純化結(jié)果

圖1 MLP的DEAE-52纖維素洗脫曲線圖Fig.1 Elution curves of MLP on DEAE-52 cellulose column

經(jīng)過乙醇脫脂、熱水浸提、除蛋白和色素、濃縮醇沉、凍干后得到MLP，其得率為8.54%，糖含量為45.87%。MLP的DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線見圖1。MLP經(jīng)柱層析后得到4個組分，其中以水為洗脫液得到的中性多糖為MLP-1，以0.1，0.3和0.5 mol/L的NaCl溶液洗脫得到的酸性多糖分別為MLP-2、MLP-3、MLP-4。MLP-1、MLP-2、MLP-3、MLP-4的糖含量分別為88.46%，78.18%，69.42% 和67.35%，得率分別為0.25%，0.65%，1.43% 和1.78%。隨著洗脫液離子強度的增加，4個組分的得率依次上升，但糖含量逐漸下降，可能是隨著NaCl濃度的提高，有部分色素和小分子物質(zhì)液也被洗脫，造成多糖純度下降[14]。

2.2 桑葉多糖的分子質(zhì)量

凝膠色譜(GPC)法檢測桑葉多糖各組分的分子質(zhì)量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，桑葉多糖4個組分都含有2個或2個以上的峰，這表明經(jīng)DEAE-52纖維素純化后的多糖組分還含少量雜質(zhì)。其中4個組分的主要多糖組分的分子質(zhì)量分別為6.14，8.08，10.25和2 017.55 ku。多糖分子質(zhì)量的大小與張曉[10]的研究結(jié)果相似。

圖2 桑葉多糖各組分的GPC圖譜Fig.2 GPC chromatogram of mulberry leaf polysaccharide components

2.3 桑葉多糖的單糖組成

將不同質(zhì)量濃度的單糖混標溶液進行乙酰衍生化后分別進樣檢測，結(jié)果見圖3a。由圖3a可知，6種單糖可以有效地分離，峰1至峰6依次為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，出峰時間依次為26.152，27.015，27.746，39.742，40.641和42.573 min。將桑葉多糖各組分溶液進行乙酰衍生化后分別進樣檢測，結(jié)果見圖3b～e。將多糖樣品的GC譜圖與單糖混標的GC譜圖對比確定樣品的單糖組成，采用面積歸一法計算單糖組成摩爾百分比，結(jié)果見表2。桑葉多糖各組分均由以上6種單糖組成，不同的組分單糖組成的物質(zhì)的量比情況不同，其中MLP-3、MLP-4組分存在部分雜峰，原因可能是在DEAE-52纖維素柱層析過程中，高濃度的NaCl溶液洗脫下部分色素和小分子物質(zhì)。

a)單糖混標；b)MLP-1；c)MLP-2；d)MLP-3；e)MLP-4。圖3 單糖混標乙?；a(chǎn)物和桑葉多糖各組分乙?；a(chǎn)物的GC圖譜Fig.3 GC chromatogram of acetylated derivative of standard monosaccharides

表2 桑葉多糖各組分的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of mulberry leaf polysaccharide components

結(jié)果表明，桑葉多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，而木糖和甘露糖含量比較少。中性多糖組分MLP-1主要由半乳糖和阿拉伯糖組成，鼠李糖含量較少，而酸性多糖組分MLP-2、MLP-3、MLP-4中鼠李糖含量明顯高于中性多糖，且鼠李糖的含量隨著洗脫劑濃度的增加而增加，均與汪葉青[15]的研究結(jié)果高度類似。但也有研究表明，從桑葉粗多糖中分離出的中性多糖組分鼠李糖含量比較高，可能和提取分離方法及桑葉產(chǎn)地不同有關(guān)[16]。此外，本研究中的所有多糖組分均未檢測出半乳糖醛酸和糖醛酸。這可能和醇沉的濃度相關(guān)，有研究報道，在低濃度乙醇沉淀下，糖醛酸含量比較高，而隨著乙醇濃度的增加，糖醛酸的含量逐漸減少，當醇含量超過80%時，醇沉得到的多糖中幾乎不含糖醛酸[17]。

圖4 桑葉多糖各組分的紅外光譜圖Fig.4 IR spectroscopy analysis of mulberry leaf polysaccharide components

2.4 桑葉多糖的紅外光譜

2.5 桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

桑葉多糖各組分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖5。由圖5可知，在桑葉多糖的4種純化組分中，僅MLP-1表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且在0～5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，IC50值為0.503 8 mg/mL。而MLP-2、MLP-3、MLP-4在質(zhì)量濃度為0～5 mg/mL的范圍內(nèi)，對α-葡萄糖苷酶的抑制率均為0，說明酸性多糖對α-葡萄糖苷酶沒有抑制作用。造成這種差異的原因可能在于多糖所帶電荷、單糖組成等因素，MLP-1為經(jīng)水洗脫得到的中性多糖，而其他3個為氯化鈉溶液洗脫得到的酸性多糖；此外，還可能是因為中性多糖含有較少的色素和其他雜質(zhì)，純度更高，因此抑制效果顯著。而未經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化的MLP，含有少量的MLP-1組分，使其對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出微弱的抑制作用。

圖5 桑葉多糖各組分對α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of mulberry leaf polysaccharide components on α-glucosidase

2.6 桑葉多糖MLP-1組分對α-葡萄糖苷酶的抑制類型

建立不同濃度α-葡萄糖苷酶在不同濃度MLP-1反應(yīng)下與反應(yīng)初速度的關(guān)系，結(jié)果見圖6。由圖6可知，酶濃度與反應(yīng)速率具有良好線性關(guān)系，均經(jīng)過原點，添加MLP-1的直線斜率小于未加MLP-1直線斜率，且隨濃度逐漸增大，直線斜率逐漸減小，這屬于可逆性抑制的典型特征[13]。表明MLP-1的添加，并未增加或減少酶的濃度，而是通過降低酶活性使其分解底物濃度降低。因此，可判斷MLP-1對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于可逆抑制類型。

圖6 MLP-1對α-葡萄糖苷酶抑制機理Fig.6 Inhibition kinetics of MLP-1 on α-glucosidase

2.7 桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的可逆抑制動力學(xué)

通過固定α-葡萄糖苷酶濃度，改變MLP-1與PNPG的濃度，繪出Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，結(jié)果見圖7，通過計算得到表3。不同濃度抑制劑的擬合曲線與空白組相交于軸，最大反應(yīng)速率Vm隨著樣品濃度的增加逐漸降低，米氏常數(shù)Km為1.394 1 mmol/L，具有非競爭型抑制的典型特征，說明MLP-1與α-葡萄糖苷酶的非活性部位相結(jié)合，形成“MLP-1-酶”的絡(luò)合物后會進一步與PNPG結(jié)合，MLP-1和PNPG分別獨立地與酶的不同部位相結(jié)合，PNPG濃度的改變對抑制程度無影響[22-23]。

圖7 MLP-1對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖Fig.7 Lineweaver-Burk double reciprocal graph of the inhibitory effect of MLP-1 on α-glucosidase

表3 MLP-1抑制α-葡萄糖苷酶動力學(xué)參數(shù)Table 3 Inhibition kinetic parameters of MLP-1 on α-glucosidase

3 結(jié) 論

采用水提醇沉法制備得到桑葉多糖(MLP)，進一步用離子交換柱層析分離純化得到4個桑葉多糖組分(MLP-1、MLP-2、MLP-3和MLP-4)，對其分子質(zhì)量、單糖組成和基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)進行了分析，并深入研究了桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制動力學(xué)，得出以下結(jié)論：

1)4個多糖組分(MLP-1、MLP-2、MLP-3和MLP-4)的分子質(zhì)量依次為6.14,8.08,10.25和2 017.55 ku；4個多糖組分均由6種單糖包括鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，但具有不同的單糖物質(zhì)的量比；4個多糖組分具有典型的多糖特征吸收峰，含有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

2)4個多糖組分中僅MLP-1 對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，IC50值為0.503 8 mg/mL，而其他3個多糖組分(MLP-2、MLP-3和MLP-4)對α-葡萄糖苷酶的抑制率均為0。MLP-1對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用類型屬于可逆抑制，MLP-1和PNPG分別獨立地與酶的不同部位相結(jié)合，PNPG濃度的改變對抑制程度無影響。

通過對桑葉多糖中抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效成分進行深入探究，將有助于明晰其藥效成分及作用機制，為桑葉多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。