溫 柔，王曉晴，孫允紅，楊 穎， 侯 林

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東 青島266000)

五加皮酒是以五加皮為主藥，在民間廣泛流傳配制的傳統(tǒng)藥酒，具有祛風(fēng)濕、痿痹、壯筋骨，填精髓等功效[1]。唐·《外臺(tái)秘要》[2]記載的五加皮酒方詳細(xì)記述了五加皮酒的制備工藝，其方為“五加根莖細(xì)刨五斗，六月六日曲未三斗，黍米一石，糯米亦得。以五斗共五加同下于大釜中，以木度深淺，與水準(zhǔn)刻之，即更添水一石五斗，并前計(jì)兩石……”先以水煎五加皮取汁浸曲，再煎其藥渣取汁與黍米共煮，放涼加曲發(fā)酵而成。

目前市面上生產(chǎn)的五加皮酒，多以糧食白酒為酒基，配以多味藥材經(jīng)浸泡、配制、調(diào)色等工藝而制成[3]。白酒即蒸餾酒，普遍酒精度數(shù)偏高，蒸餾酒古稱“燒酒”，《本草綱目》載“燒酒，味辛、甘，性大熱，有大毒”。傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒采用的是傳統(tǒng)黃酒釀造工藝制備，酒精度普遍較低。當(dāng)前對(duì)于使用傳統(tǒng)黃酒釀造工藝制備五加皮酒的研究相對(duì)空白，本研究基于《外臺(tái)秘要》中記載的五加皮酒方，對(duì)傳統(tǒng)五加皮酒進(jìn)行處方考證。在古方的基礎(chǔ)上對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒制備工藝進(jìn)行研究，得到五加皮最佳水提及糖化工藝，為傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 處方考證

1.1 處方沿革

《神農(nóng)本草經(jīng)》[4]記載最早的釀造五加皮酒大概出自戰(zhàn)國(guó)時(shí)期。《外科大成》[5]記載：杰出的本草學(xué)家陶弘景就錄：“用單味五加皮，煮根莖釀酒，主益人。”《本草綱目》[6]記載五加皮酒的制備方法“用五加皮刮去骨，煎汁和麴米釀成飲之?；蚯兴榇?，浸酒煮飲，或加牛膝、當(dāng)歸、地榆諸藥”。唐·《外臺(tái)秘要》[7]記載的五加皮酒方則詳細(xì)記述了單味五加皮酒的制備工藝，其方“五加根莖細(xì)刨五斗，六月六日曲未三斗，黍米一石，糯米亦得……”先以水煎五加皮取汁浸曲，再煎其藥渣取汁與黍米共煮，放涼加曲發(fā)酵而成?！秱浼鼻Ы鸱健穂8]記載五加皮酒方：“五加皮、枸杞根白皮各一斗。以水一石五斗煮取汁七斗，分取四斗浸曲一斗，余三斗用拌飯下米，多少如常釀法。”《太平圣惠方》[9]記載的五加皮酒為浸漬法制備：“五加皮細(xì)銼一升，以清酒一斗。漬十日，溫服一中盞?！蔽墨I(xiàn)考證可知，傳統(tǒng)的五加皮酒大多是采用釀造法制備而來。先水煎煮五加皮得到五加皮水提液及藥渣，然后將五加皮水提液及藥渣與米、曲共同發(fā)酵。

1.2 藥材基原

五加皮最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，又名五加，尚有材漆、五花、木骨、追風(fēng)使、刺通、白剌等異名[10]?！睹t(yī)別錄》有載：“五加皮，五葉者良，生漢中及冤句，五月、七月采蓮，十月采根，陰干?！蔽寮悠ぞ哂凶萄a(bǔ)、祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨等功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》[11]言其“主心腹疝氣，腹痛，益氣，療蹩、小兒不能行、疸創(chuàng)陰蝕?！睍惺状翁岢鑫寮泳哂幸鏆狻燉康淖饔??！睹t(yī)別錄》[12]云：“男子陽(yáng)瘓，囊下濕，小便余瀝，女人陰癢及腰脊痛，兩腳痛風(fēng)弱，五緩，虛嬴，補(bǔ)中益精，堅(jiān)筋骨，強(qiáng)志意，久服輕身耐老?！薄缎滦薇静荨分嘘P(guān)于五加皮功效的記載，且云“久服輕身耐老……五葉者良?！薄侗静菟急驿洝份d：“五加皮，宜下焦風(fēng)濕之緩證。若風(fēng)濕搏于肌表，則非其所司。古方多浸酒醜酒，及酒調(diào)末服之，以行藥勢(shì)?！?020年版《中國(guó)藥典》[13]收錄五加皮為五加科植物細(xì)柱五加皮Acanthopanax gracilistylusW.W. Smith的干燥根皮。

1.3 藥材炮制

《外臺(tái)秘要》記載的五加皮酒方，詳細(xì)記述了五加皮的炮制方法：“五加根莖細(xì)刨五斗，六月六日曲未……”《太平圣惠方》記載“五加皮細(xì)銼一升……”仲景云：“銼如麻豆大，與咀同義。咀，古之制也，古無(wú)鐵刃，以口咬細(xì)，令如麻豆，為粗藥煎之，使藥水清飲于腹中，則易升易散也，此所謂咀也。今人以刀器銼如麻豆大，此咀之易成也。”[1“4]如麻豆大”在煮散的粒度描述中十分常見，“麻豆”在歷代古籍文獻(xiàn)中卻未見有明確記載。但“麻”在歷代古籍文獻(xiàn)中均有明確且統(tǒng)一的釋義，即我國(guó)傳統(tǒng)種植的大麻，古代五谷之一的大麻籽實(shí)以及古代百姓衣著及喪服所用的麻布均來源于大麻[15]?！奥椤睘樯？浦参锎舐?，“麻豆”為大麻的成熟果實(shí)，即火麻仁。2020 年版《中國(guó)藥典》中記載火麻仁呈卵圓形，長(zhǎng) 4 ～ 5.5 mm，直徑 2.5 ～ 4 mm。因此，“麻豆大”推測(cè)為2 ～ 5 mm。而 4目篩孔徑為 4.75 mm，一號(hào)篩（10目）的孔徑則為2.00 mm[16-19]。因此，“如麻豆大”可取過4目篩但不過一號(hào)篩（10目）的粗顆粒。由此推測(cè)，《外臺(tái)秘要》記載的五加皮酒方中五加皮應(yīng)取粉碎后過4目篩但不過10目篩的粗粉。

1.4 計(jì)量考證

原方中記載五加皮用量為五斗，黍米為一石，水為兩石。已知五加皮粉碎的粒度，由此可以計(jì)算出五加皮粉末的密度。實(shí)驗(yàn)得到五加皮粉末松密度和振實(shí)密度分別為0.412、0.410，黍米的松密度和振實(shí)密度分別為0.831、0.836。查閱文獻(xiàn)可知古代與現(xiàn)代換算關(guān)系：1斗 = 2 000 mL，一石 = 10斗[20]。由此可推出，五加皮∶黍米∶水= 1∶4∶10。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備工藝研究

2.1 材料

2.1.1 儀器 2695型高效液相色譜儀包括2998型檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；DK-S14 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9140B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱［中儀國(guó)科（北京）科技有限公司］；FA2104型萬(wàn)分之一電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；CPA225D 型十萬(wàn)分之一電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ-500E 型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；LA759 型超純水機(jī)（英國(guó) ELGA 公司）。

2.1.2 藥材及試劑 黍米購(gòu)自沈陽(yáng)信昌糧食貿(mào)易有限公司；五加皮（生產(chǎn)批號(hào)：210601）購(gòu)自青島天成中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)侯林副教授鑒定，均符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）相關(guān)項(xiàng)下要求；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：Y24J7K16726，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：20191029，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸為分析純；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2.2 工藝流程

五加皮粉碎過篩后煎煮得到五加皮水提液及藥渣。黍米經(jīng)浸泡、洗米、燙米后與五加皮水提液及藥渣共煮進(jìn)行煮糜。將煮好的糜倒入消毒后的鐵盤中，使其快速降溫。降到指定溫度后加入麥曲進(jìn)行糖化。糖化結(jié)束后加入酵母，轉(zhuǎn)移至缸中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵7 d后過濾取濾液，將過濾后的酒液置于85℃水浴30 min，即可。

2.3 五加皮水提工藝研究

2.3.1 樣品溶液制備 取五加皮粗粉50 g于圓底燒瓶中，加入水，浸泡，回流，得到五加皮水提液，將提取液離心、過濾、定容至500 mL。

2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，按方法測(cè)定浸出物含量和綠原酸含量，對(duì)浸出物含量和綠原酸含量進(jìn)行綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分為指標(biāo)，正交因素水平見表1。

表1 五加皮水提工藝正交因素水平表Tab. 1 Level table of orthogonal factors water extraction technology of Acanthopanacis Cortex

2.4 五加皮糖化工藝研究

2.4.1 糖化液的制備 取黍米500 g，浸泡24 h后進(jìn)行燙米，再浸泡24 h，與五加皮提取液及藥渣共煮進(jìn)行糊化，攤涼，加入麥曲糖化，得到糖化液。

2.4.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以還原糖為指標(biāo)，正交因素水平見表2。

表2 五加皮糖化工藝正交因素水平表Tab. 2 Level table of orthogonal factor of saccharification process of Acanthopanacis Cortex

2.5 方法

2.5.1 浸出物含量測(cè)定 精密量取25 mL水提液于干燥至恒重的蒸發(fā)皿，水浴蒸干。105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，平行測(cè)定兩次，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量。

2.5.2 綠原酸含量測(cè)定 （1） 色譜條件 色譜柱為WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（B）-0.05%磷酸水（A），梯度洗脫（0 ～ 10 min，5% →10%B，10 ～ 30 min，10% →15%B，30 ～ 40 min，15%→85%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

（2） 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5.08 mg綠原酸對(duì)照品，加甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，即得。

（3） 供試品溶液的制備 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下樣品溶液25 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，過濾，取濾液。

（4） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取規(guī)定配制的綠原酸對(duì)照品溶液2.5 mL，按半倍稀釋法，定容至5 mL容量瓶中，依次得到濃度為0.031 15、0.062 23、0.124 46、0.248 92、0.497 84、0.995 68 mg/mL系 列對(duì)照品。按“2.5.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3 還原糖含量測(cè)定 （1） 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取50 mg經(jīng)105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（2） 供試品溶液的制備 取“2.4.1”項(xiàng)下糖化液4 000 r/min離心20 min，上清液定容至100 mL容量瓶，取上清液1 mL定容至100 mL容量瓶中，得到供試品溶液。精密吸取1 mL供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算還原糖含量。

（3） 線性關(guān)系考察 采用 3,5－二硝基水楊酸比色法。分別精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7 mL 置于10 mL 具塞試管中，蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，加入 3,5－二硝基水楊酸試劑1.5 mL，將各試管中的溶液混合均勻，沸水浴 5 min 取出，立即冷卻至室溫，定容至刻度，搖勻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.5.4 浸出物和綠原酸權(quán)重系數(shù)確定 采用CRITIC法[21-24]。CRITIC法是一種客觀權(quán)重賦權(quán)法，它以兩個(gè)基本概念為基礎(chǔ)，一是對(duì)比強(qiáng)度，以標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表現(xiàn); 二是評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的沖突性，以指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，故該方法是基于評(píng)價(jià)指標(biāo)的對(duì)比強(qiáng)度和指標(biāo)之間的沖突性來綜合衡量指標(biāo)的客觀權(quán)重，在考慮指標(biāo)變異性大小的同時(shí)兼顧指標(biāo)之間的相關(guān)性，完全利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 五加皮水提工藝研究

3.1.1 綠原酸HPLC分析結(jié)果 按照“2.5.2（2）（3）”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和五加皮供試品溶液，按“2.5.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。色譜圖見圖1、圖2，各峰之間分離度足夠，峰形良好，可以用于樣品的HPLC分析。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig. 1 HPLC of chlorogenic acid standard

圖2 五加皮供試品HPLC圖譜Fig. 2 HPLC of Acanthopanacis Cortex sample

3.1.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“2.5.2（4）”項(xiàng)下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，綠原酸對(duì)照品溶液濃度（X，mg/mL）和峰面積（Y）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y= 8×106X+ 152 965，R2= 0.999 6，表明綠原酸對(duì)照品在0.031 15 ～ 0.995 68 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn) 取綠原酸對(duì)照品，連續(xù)進(jìn)樣6次，得峰面積，計(jì)算RSD = 0.21%，表明儀器精密度良好。

（2） 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份制備的同一批供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，得峰面積，計(jì)算綠原酸含量，RSD = 1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3） 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h按“2.5.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得2種溶液中綠原酸峰面積RSD分別為0.58%、1.7%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4） 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取125 mL濃度為0.154 5 mg/mL樣品溶液于250 mL容量瓶中，定容至刻度作為供試品溶液。精密吸取6份 25 mL供試品，精密稱取對(duì)照品2.00 mg，制備供試品溶液，按“2.5.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得平均回收率為101.82%，RSD為0.31%。

3.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，溶劑量的均方值最大，即溶劑量對(duì)五加皮水提液中浸出物含量和綠原酸含量影響最大，其次為浸泡時(shí)間，最后為煎煮時(shí)間，即B＞A＞C。由表4分析可知，因素B具有顯著影響（P＜0.05），而A、C不具有顯著影響（P＞0.05）。最終確定五加皮最佳水提工藝為A2B3C2，即浸泡時(shí)間為40 min、溶劑量為12倍、煎煮時(shí)間為90 min。

表3 五加皮水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表Tab. 3 Orthogonal test results table of water extraction of Acanthopanacis Cortex

表4 五加皮水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab. 4 Orthogonal test results analysis of variance table of Acanthopanacis Cortex

3.1.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 按“3.1.3”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行 3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5，浸出物含量、綠原酸含量及綜合評(píng)分RSD均小于3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表5 五加皮水提工藝驗(yàn)證（n = 3）Tab. 5 Process validation of Acanthopanacis Cortex （n = 3）

3.2 糖化工藝研究

3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“2.5.3（3）”項(xiàng)下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，葡萄糖對(duì)照品溶液濃度（X，mg/mL）和吸光度（Y）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y= 0.014 4X- 0.047 6，R2= 0.999 9，表明葡萄糖對(duì)照品溶液在10 ～ 70 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 方法學(xué)考察 （1） 精密度試驗(yàn) 取濃度為70 μg/mL的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，得吸光度，RSD = 0.12%，表明儀器精密度良好。

（2） 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批供試品溶液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算還原糖含量，RSD = 3.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3） 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度，RSD =0.39%，表明溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

（4） 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取0.5 mL濃度 為69.49 μg/mL供 試 品 溶 液6份 于10 mL試 管中，分別加入0.5 mL濃度為70.8 μg/mL的對(duì)照品溶液，按方法顯色，測(cè)定吸光度，測(cè)得平均回收率為97.77%，RSD為0.87%。

3.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表6可知，加曲量的均方值最大，即加曲量對(duì)糖化液中還原糖含量影響最大，其次為糖化溫度，最后為糖化時(shí)間，即A＞C＞B。由表7分析可知，因素A具有顯著影響（P＜0.05），而B、C不具有顯著影響（P＞0.05）。最終確定最佳糖化工藝為A3B3C2，即加曲量為14%、糖化時(shí)間為50 min、糖化溫度為65 ℃。

表6 糖化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表Tab. 6 Table of orthogonal test results of saccharification process

3.2.4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證 按“3.2.3”項(xiàng)下最佳工藝進(jìn)行 3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表8，還原糖含量RSD＜3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表 7 糖化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab. 7 Orthogonal test results ANOVA table of saccharification process

表8 糖化工藝驗(yàn)證（n = 3）Tab. 8 Process validation of saccharification process（n = 3）

4 討論

中藥酒劑，也稱藥酒，屬于中藥的傳統(tǒng)劑型，使用歷史悠久?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定藥酒為蒸餾酒提取制成的澄清液體制劑。蒸餾酒古稱“燒酒”，《本草綱目》載“燒酒，味辛、甘，性大熱，有大毒”[25]。而高度蒸餾酒導(dǎo)致的安全性問題正是制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。臧貴勇等[26]研究了水族抗痹癥藥酒的急性毒性，結(jié)果顯示抗痹癥藥酒小鼠一次經(jīng)口給藥 LD50=29. 664 mL/kg，白酒對(duì)照組小鼠一次經(jīng)口給藥 LD50=27. 222 mL/kg，說明白酒是導(dǎo)致藥酒毒性的關(guān)鍵因素。現(xiàn)代藥酒的生產(chǎn)多是以糧食白酒為酒基，配以多種藥材經(jīng)過浸泡、勾兌而成。以傳統(tǒng)釀造法制備的藥酒不僅酒精度低，對(duì)人體危害小，而且在釀造過程中引入原料米的活性物質(zhì)，具有安全、健康、口感豐富的特點(diǎn)，符合現(xiàn)代人追求的養(yǎng)生保健生活方式。

釀造法制備藥酒是我國(guó)傳統(tǒng)藥酒制備方法，《本草綱目》中記載的68個(gè)藥酒均是以釀造法制備?；仡櫵幘频钠鹪春桶l(fā)展，得到兩點(diǎn)認(rèn)識(shí)：一是在古代至少清代以前“酒”指的是釀造法制備而來的低度酒，藥酒的溶劑也是釀造法制備而來的低度酒；二是釀制法工藝是古代藥酒生產(chǎn)的主要工藝。進(jìn)入現(xiàn)代，工業(yè)化規(guī)模化生產(chǎn)的藥酒已經(jīng)取代了小作坊生產(chǎn)，滅菌工藝成熟，制約釀制法工藝的技術(shù)因素已經(jīng)不復(fù)存在，可以考慮將釀制法工藝重新引入藥酒的生產(chǎn)。

5 結(jié)論

本研究以古籍《外臺(tái)秘要》中記載的五加皮酒方為基礎(chǔ)，從處方沿革、藥材基原、藥材炮制及計(jì)量考證對(duì)傳統(tǒng)五加皮酒進(jìn)行處方考證，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒制備工藝中的五加皮水提工藝和糖化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并驗(yàn)證了這兩個(gè)工藝的可行性，為傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備研究提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。