健胃清腸合劑對不完全性腸梗阻大鼠腸黏膜免疫屏障功能影響的實驗研究*

李彥龍，任彥彥，呂巧瑩，徐中，張旭彤，李生財

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 慶陽市中醫(yī)院；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；4 甘肅省中醫(yī)藥研究院

不完全性腸梗阻（incomplete intestinal obstruction）是腸腔內(nèi)容物不能完全通過梗阻部位而出現(xiàn)陣發(fā)性腹部絞痛、腹脹、惡心嘔吐、停止排便排氣等急腹癥表現(xiàn)的一類疾?。?］。本病后期可導(dǎo)致毒血癥、休克及死亡，嚴重危害人類健康。治療方法分為手術(shù)療法與非手術(shù)療法，在非手術(shù)療法中，中醫(yī)藥治療腸梗阻手段豐富，方法多樣，臨床療效確切，具有安全持久、簡便廉驗等優(yōu)點［2-3］。健胃清腸合劑是國家級名老中醫(yī)廖志峰研制的院內(nèi)制劑，前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)該藥治療腸梗阻、便秘、胃腸脹氣等疾病療效可靠，安全性高［4-6］。臨床發(fā)現(xiàn)健胃清腸合劑對胃腸黏膜有保護作用，該藥對胃腸黏膜屏障的影響極可能是其發(fā)揮作用的重要機制。本研究采用ELISA法檢測在不同劑量健胃清腸合劑作用下不完全性腸梗阻大鼠模型血清中炎性因子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）及α-干擾素（interferon-α，IFN-α）的表達水平，研究健胃清湯合劑對大鼠腸黏膜免疫屏障功能的影響，為該藥進一步的開發(fā)與推廣提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級Wistar雄性大鼠112只，體質(zhì)量（220±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（甘）2015-0005。飼養(yǎng)條件：給予大鼠滅菌飼料及滅菌水正常飼養(yǎng)。本研究動物實驗符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會制定的《有關(guān)動物實驗指導(dǎo)原則》要求。

1.2 藥物及儀器健胃清腸合劑（甘肅省中醫(yī)院藥物制劑中心，甘藥制字Z11012103，規(guī)格：250 mL/瓶）；石蠟油（南昌白云藥業(yè)有限公司；贛食藥準字F20050005；規(guī)格：500 mL/瓶）。IL-6與IL-10試劑盒（聯(lián)科生物公司）；IFN-α試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，批號：88-7340）。PL-203型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機（Heal Force）；DW-86L626型超低溫冰箱（海爾有限公司）；FBZ2001-UP-P型純水儀（青島富勒姆科技）；TL-420D型水浴鍋（姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司）；移液器（大龍）：KA006318型300μL多道移液器（大龍）；YE3K030591型200μL移液器（大龍）；KE0012951型10μL移液器（大龍）；Epoch型酶標檢測儀（BioTeK）。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備參照文獻［7］將大鼠用10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，固定于鼠臺，備皮，碘伏消毒，于腹中下l/3處開腹，暴露回盲部，用16 Go的中心靜脈導(dǎo)管與回腸腸管并排放置，然后在距離回盲部l cm處使用圓針帶7號絲線穿透腸系膜并繞過回腸腸管，將中心靜脈導(dǎo)管與回腸腸管一并結(jié)扎，最后抽出中心靜脈導(dǎo)管。造模成功標志：由于腸管梗阻，腸道食物無法順利通過梗阻部位排出體外，所以造模大鼠每天糞便的干重減輕、顆數(shù)減少，造模大鼠能夠排便但排便減少，說明已對大鼠造成不完全性腸梗阻，標志著造模成功。

1.3.2 動物分組遵從隨機、均衡原則，采用隨機數(shù)字表法將112只大鼠分為正常組，假手術(shù)組，模型組，陽性對照組，健胃清腸高、中、低劑量組共7組，每組16只。假手術(shù)組麻醉、開腹等方法同前，開腹后用中心靜脈導(dǎo)管與回腸腸管并排置，并用針線穿透腸系膜繞過腸管但不結(jié)扎；正常組不做任何處理；其余各組大鼠制備不完全性腸梗阻大鼠模型。

1.3.3 藥物制備健胃清腸合劑：該藥臨床上成人使用常規(guī)劑量約為2 mL/kg體質(zhì)量［按人鼠面積比值公式計算（10 mL/kg）］。為方便實驗時灌胃操作，將原藥分別濃縮或稀釋調(diào)配成含有原藥濃度分別為3.3、1.65、0.825 mL/mL的混合液備用。石蠟油：按人鼠面積比值公式計算，將該藥與蒸餾水按照體積比1∶1混合備用，灌胃時充分搖勻。

1.3.4 給藥方法［8］健胃清腸各組均于手術(shù)造模前1 h，以及造模后第24、48、72 h灌胃給藥，健胃清腸各組將對應(yīng)濃度的健胃清腸合劑混合液按照10 mL/kg灌胃（高、中、低劑量組分別相當于成人常用劑量的10、5、2倍）；陽性對照組以調(diào)配好濃度的石蠟油-蒸餾水混合液充分搖勻后按照10 mL/kg灌胃；正常組、假手術(shù)組、模型組給予10 mL/kg的蒸餾水，時間同前。

1.3.5 血清制備于最后一次給藥后1 h，脫頸處死大鼠，股動脈迅速放血5 mL左右，在自然溫度下靜置15 min，待血液凝固后置于離心機中，以離心半徑8.6 cm，3500 r/min離心5 min，移取上層血清，制備血清。將制備完畢的血清標本置于-20℃超低溫冰箱冷凍保存，集中待檢。

1.4 觀察指標采用ELISA法測定血清中IL-6、IL-10及IFN-α水平，具體測定步驟按照相應(yīng)試劑說明書嚴格操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較選用t檢驗，多組間比較選用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與模型組相比，健胃清腸各劑量組大鼠血清中IL-6、IL-10及IFN-α水平均降低，尤以健胃清腸高、中劑量組降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且健胃清腸合劑高、中劑量組大鼠血清中IL-6、IL-10及IFN-α水平與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-6、IL-10、IFN-α水平比較（±s） pg/mL

注：△表示與正常組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；★表示與陽性對照組比較，P＜0.05

組別正常組假手術(shù)組模型組陽性對照組健胃清腸高劑量組健胃清腸中劑量組健胃清腸低劑量組鼠數(shù)16 16 16 16 16 16 16 IL-6 3.91±3.20 4.33±3.35 9.45±3.97Δ 6.21±2.38 5.64±1.52▲★5.83±1.94▲★6.15±3.04 IL-10 24.36±8.44 26.17±9.63 31.60±14.21Δ 21.67±1.22 18.56±7.90▲★19.73±10.02▲★21.01±10.76 IFN-α 287.74±110.08 197.84±72.71 784.72±228.26Δ 542.95±279.64 509.16±248.70▲★459.99±175.13▲★642.78±370.63

3 討論

中醫(yī)學(xué)多將不完全性腸梗阻歸屬于“腸結(jié)病”范疇。中醫(yī)理論認為六腑應(yīng)以通降為順，大、小腸均屬于六腑，凡各種因素導(dǎo)致的腸道通降功能失調(diào)，滯塞不通，都會引發(fā)本病。中醫(yī)治療不完全性腸梗阻以“通里攻下、行氣止痛、活血化瘀”為基本原則。健胃清腸合劑主要由大黃、木香、檳榔、枳殼、黃連、元明粉等藥物組成，具有清熱解毒、通里攻下之功效。臨床研究表明，該藥能夠有效減輕不完全性腸梗阻患者腹痛、腹脹等癥狀，保護胃黏膜，加快腸道機械清除速度，減少術(shù)后腸漏、腹腔膿腫和傷口感染等并發(fā)癥，降低術(shù)后腸粘連、腸梗阻的發(fā)生率，促進腸道功能的快速恢復(fù)，具有活血化瘀、抑菌消炎、提高機體免疫力等多重功效［9-11］。

腸道免疫屏障主要由集合淋巴小管、腸上皮淋巴細胞及腸固有層等腸相關(guān)淋巴組織構(gòu)成，腸相關(guān)淋巴組織與腸道內(nèi)分布的眾多免疫細胞與免疫因子共同誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，發(fā)揮腸道免疫調(diào)節(jié)作用［12］。其中腸上皮淋巴細胞內(nèi)的CD8+、CD4+細胞，在腸黏膜受到刺激時，數(shù)量增多，同時會促進分泌IL-6、IL-10及IFN-α等多種細胞因子產(chǎn)生細胞毒作用，以此對抗致病原，修復(fù)損傷的腸黏膜屏障，促進腸道的愈合［13-14］。腸梗阻時腸黏膜免疫屏障受到損傷，導(dǎo)致腸系膜相關(guān)淋巴結(jié)數(shù)量和功能出現(xiàn)異常，主要反應(yīng)在腸系膜淋巴結(jié)的增殖和凋亡，從而影響其IL-6、IL-10及IFN-α等的表達。此外，這一屏障受損時，腸道菌群也會發(fā)生移位，逆侵入腸系膜淋巴結(jié)［15］。所以，腸梗阻時腸系膜淋巴結(jié)細胞凋亡增殖狀況、腸道細菌移位量、血液中T淋巴細胞、淋巴細胞分泌入血的IL-6、IL-10、IFN-α等細胞因子能較好地反應(yīng)腸道免疫屏障的受損狀態(tài)。本實驗通過檢測IL-6、IL-10及IFN-α細胞因子的水平來反映健胃清腸合劑對不完全性腸梗阻大鼠腸黏膜免疫屏障的作用。

本實驗結(jié)果顯示，健胃清腸合劑能夠有效降低不完全性腸梗阻大鼠血清中炎性因子的水平；其機制可能與該藥能夠抑制血清中炎性因子的產(chǎn)生和（或）釋放、減少腸壁炎性物質(zhì)滲出，減輕水腫、改善腸道血液微循環(huán)等相關(guān)。本課題組同時從生物屏障、化學(xué)屏障及機械屏障方面研究了健胃清腸合劑對不完全性腸梗阻大鼠腸黏膜屏障的影響，結(jié)果均表明健胃清腸合劑對不完全性腸梗阻大鼠腸黏膜幾個屏障具有相應(yīng)的保護作用，這種保護作用極可能是本藥治療不完全性腸梗阻除其瀉下作用外顯效的重要機制，但還有待進一步深入探究。