王瑞雪，張 筠，崔艷偉，付紅巖，房一明，張彥軍，初 眾,*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；2.黑龍江東方學(xué)院食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150066）

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是目前臨床上面臨的主要治療難題之一，其本質(zhì)是由于胰島β細胞損傷或胰島素抵抗，導(dǎo)致血液中葡萄糖含量較高，通過服用降糖類藥物雖能夠達到良好的降血糖效果，但通常伴有一些毒副作用，因此尋找天然無毒副作用的的降糖成分成為研究的熱點[1]。植物多酚是一大類以羥基苯酚為特征的異質(zhì)化合物，主要的多酚亞類包括黃酮類、芪類、酚酸類和木質(zhì)素類，具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒抗腫瘤和降血糖降血脂等功效[2-7]。

檸檬（Citrus limon（L.） Burm. f.）為蕓香科柑橘屬常綠小喬木，源產(chǎn)于東南亞，截至2020 年全球檸檬產(chǎn)量約為2135 萬噸[8]。目前檸檬主要用于鮮食或制作成果汁、果醬等產(chǎn)品，產(chǎn)生經(jīng)濟效益的主要是檸檬果肉，檸檬皮通常作為廢料被掩埋處理，由于檸檬果皮中含有豐富的營養(yǎng)成分和水分，掩埋后會滋生大量細菌污染周邊水源及土壤，破壞環(huán)境的同時其營養(yǎng)成分也未得到充分利用，造成了經(jīng)濟損失和資源浪費[9-10]。目前對于檸檬皮的研究主要停留在對芳香油和果膠的提取上，對其功能性研究不夠深入，因此本文探究檸檬皮多酚的成分及其調(diào)節(jié)糖代謝的功能，為今后開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提高檸檬整體經(jīng)濟效益提供了理論依據(jù)，同時也為檸檬加工廢物處理提供了新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香水檸檬 海南省萬寧市興隆熱帶植物園4 月采摘；大孔樹脂AB-8 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；甲酸、甲醇、乙腈 色譜純，德國默克公司；人肝癌細胞（HepG2）、DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素-鏈霉素（P/S） 蘇州美侖生物科技有限公司；胎牛血清（FBS） 哈爾濱市立峰生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、MTT、鹽酸二甲雙胍 北京博奧拓達科技有限公司；重組人胰島素（40 IU/mL） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量/濃度測定試劑盒 大連美侖生物科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；糖原試劑盒、丙酮酸激酶（PK）試劑盒、己糖激酶（HK）試劑盒 南京建成生物工程研究所；G6Pase Elisa 試劑盒、PEPCK Elisa 試劑盒 北京誠林生物科技有限公司。1290 HPLC-G7117B DAD-G6546A QTOF 美國Agilent 公司；SW-CJ-2FD 凈化工作臺 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HERAcell 150i 二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo 公司；Ts2-FL 倒置顯微鏡 日本Nikon 公司；UV-1200 紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；RT-6000 酶標儀深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬皮多酚的提取和成分分析

1.2.1.1 樣品處理及提取 依據(jù)黃修晴[11]的方法提取和測定檸檬皮多酚，檸檬去皮，冷凍干燥后粉碎過60 目篩，用70%乙醇按料液比1:60，50 ℃超聲提取45 min，5000 r/min 離心10 min，重復(fù)提取3 次，合并提取液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，將提取物冷凍干燥后配制成500 mL 濃度為3 mg/mL 的上樣液，選用AB-8 大孔樹脂濕法灌柱，以2 mL/min 的流速吸附，用160 mL 蒸餾水洗去可溶性糖和雜質(zhì)，使用70%乙醇溶液以1 mL/min 的流速進行洗脫，洗脫液50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，冷凍干燥，得純度為81.67%的LPP 凍干粉，于-20 ℃密封冷凍保存，取少量檸檬皮多酚溶于甲醇，濃度為1 mg/mL，過0.22 μm 尼龍濾膜用于后續(xù)儀器分析。

1.2.1.2 液相條件 色譜柱Agilent EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×150 mm），柱溫：45 ℃，流速：0.4 mL/min，進樣量：1 μL，DAD 檢測波長：254 nm、280 nm，波長范圍：190～400 nm，流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，以5%流動相A 和95%流動相B 洗脫60 min。

1.2.1.3 質(zhì)譜條件 選擇Agilent Dual AJS ESI 源，進行正離子模式掃描，干燥氣溫度及流速：300 ℃、5 L/min，霧化器電壓：45 psi，鞘氣溫度及流速：350 ℃、11 L/min，Vcap 電壓：3500 V，毛細管出口電壓：135 V，MS 掃描范圍：100～1700 m/z，MS 掃描速率：4 s。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及IR-HepG2 細胞模型建立

1.2.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2 細胞培養(yǎng)基以89%DMEM 培養(yǎng)基+10% FBS+1% P/S 配制，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 按1:3 傳代[12]。

1.2.2.2 細胞模型建立 取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×104個細胞接種于98 孔板，待貼壁后，用10-6mol/L的胰島素作用于HepG2 細胞24 h，建立胰島素抵抗模型[13-14]。

1.2.3 LPP 對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗量及存活率的影響 參考王夢麗[15]的方法，設(shè)空白組（不含細胞）、空白對照組（正常HepG2 細胞）、模型組（IRHepG2 細胞）、陽性對照組（0.05 mg/mL 二甲雙胍）以及LPP 樣品組（LPP 濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL 的完全培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)24、48、72 h，采用MTT 法[16]測定LPP 干預(yù)后IR-HepG2 細胞存活率，用葡萄糖檢測試劑盒測定培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，根據(jù)公式（1）、（2）計算不同濃度的檸檬皮多酚對IR-HepG2 細胞存活率和葡萄糖消耗量的影響。

式中：ΔM 表示葡萄糖消耗量（mmol/L）；m 表示空白組葡萄糖含量（mmol/L）；n 表示樣品組葡萄糖含量（mmol/L）。

1.2.4 LPP 對IR-HepG2 細胞糖代謝途徑的影響細胞在T25 瓶中培養(yǎng)，設(shè)立空白組、空白對照組、模型組、陽性對照組（同1.2.3）和LPP 組（LPP 濃度分別為0.1、0.5、1 mg/mL 的完全培養(yǎng)基），經(jīng)過建模和給藥處理后，棄上清，PBS 清洗2 次，加入1 mL 胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化后收集細胞。1000 r/min 離心5 min 棄上清，用PBS 清洗。再離心，棄上清，用1 mL PBS 重懸，冰水浴條件下200 W 超聲破碎細胞5 s 一次，重復(fù)30 次，之后-4 ℃冷凍離心取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用試劑盒測定LPP 對IR-HepG2細胞糖代謝中糖原含量、HK、PK、PEPCCK 和G6Pase 活性的影響。蒽酮法測定糖原含量；比色法檢測HK、PK 活性；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測PEPCCK、G6Pase 活性，具體操作按照試劑盒說明書進行，其含量以蛋白量作為計量單位（參照BCA 試劑盒說明書的方法進行測定），評價LPP 對IR-HepG2 細胞糖代謝的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

液質(zhì)數(shù)據(jù)用Agilent Mass Hunter Workstation的Qualitative Analysis 10.0 軟件進行分析；細胞試驗每組重復(fù)5 次，采用Excel 2010、Origin 2019b、SPSS17.0 進行繪圖及數(shù)據(jù)分析，采用Duncans’法進行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬皮多酚HPLC-QTOF-MS 結(jié)果分析

根據(jù)質(zhì)譜掃描結(jié)果對液相色譜的11 個峰進行定性分析，依據(jù)樣品先經(jīng)過DAD 檢測器再進入質(zhì)譜檢測器的原理，與液相色譜圖的保留時間相比總離子流色譜圖的保留時間會相對延后，圖1 和圖2 為正離子掃描模式下的總離子流色譜圖與液相色譜圖出峰情況，依據(jù)液相色譜出峰位置找到相應(yīng)總離子流色譜圖（Total Ion Chromatogram，TIC）出峰位置提取色譜圖（Extracted Ion Chromatogram，EIC），獲得化合物的分子離子峰（如[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+）信息，根據(jù)分子離子峰響應(yīng)、峰形以及軟件自動生成分子式的偏差得到該峰的分子式和母離子，再依據(jù)保留時間到MS/MS 上尋找相應(yīng)的母離子被撞擊后形成的子離子，根據(jù)丟失的碎片數(shù)結(jié)合相關(guān)文獻最終推測出物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

圖1 檸檬皮多酚總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatography of lemon peel polyphenols

圖2 檸檬皮多酚高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of lemon peel polyphenols

具體的多酚化合物分析以峰9（b）為例，圖3（A）為峰9（b）的EIC 圖，（B）為一級質(zhì)譜圖，（C）為二級質(zhì)譜圖。

從圖3（A）和（B）中可以看出該組分在存在[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰，響應(yīng)和峰形良好，其母離子為m/z 611.1974，軟件自動生成分子式C28H34O15，計算出[M+H]+理論值為m/z 611.1970，實際值與理論值偏差為0.39，圖3（C）為母離子m/z 611.1960 打碎后得到的碎片離子，子離子峰m/z 303 是[M+H-146-162]+得到的，m/z 465 是[M+H-146]+得到的，其中m/z 146 為鼠李糖基（C6H10O4）、m/z 162 為葡萄糖基（C6H10O5），結(jié)合軟件分析和于國華等[17]的鑒定結(jié)果最終推測峰9（b）組分為橙皮苷，通過文獻檢索比對和軟件分析共鑒別出12 種物質(zhì)，結(jié)果見表1。本文僅對LPP 的成分做了初步推測，為了驗證推測成分的準確性，后續(xù)需進一步做傅里葉紅外光譜分析、核磁共振氫譜分析或者購買標準品進行驗證試驗。

表1 LPP 成分分析結(jié)果Table 1 The results of LPP component analysis

圖3 峰9（b）的EIC 圖（A）、一級質(zhì)譜圖（B）和二級質(zhì)譜圖（C）Fig.3 EIC spectra (A)、MS spectra (B) and MS/MS spectra (C) of peak 9(b)

2.2 LPP 對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗量及存活率的影響

用0.1～2.5 mg/mL 的LPP 分別作用于IR-HepG2細胞24、48、72 h，測定葡萄糖含量，如圖4。

由圖4 可知，各組葡萄糖消耗量隨時間的增加逐漸降低，出現(xiàn)這個趨勢的原因極可能是與細胞活性有關(guān)，隨著培養(yǎng)時間增加，細胞存活率逐漸下降，利用葡萄糖的能力有所下降[25]。模型組的葡萄糖消耗量在各時間段均顯著低于空白對照組，說明細胞出現(xiàn)了葡萄糖代謝異常。與模型組相比，陽性對照組和LPP 濃度為0.1～1 mg/mL 時的葡萄糖消耗量在各時間段均顯著（P＜0.05）高于模型組，且在LPP 濃度為0.5 mg/mL 時葡萄糖消耗量整體達到了峰值，在24 h 時最高（4.78±0.13 mmol/L），比模型組的葡萄糖消耗率提高15.1%。與陽性對照相比在LPP 濃度為0.1～1 mg/mL 時各時段的葡萄糖消耗量與陽性對照差異不顯著（P＞0.05），說明LPP 在這個濃度范圍內(nèi)與0.05 mg/mL 的二甲雙胍改善胰島素抵抗的能力相近，因此后續(xù)試驗的濃度設(shè)置在0.1～1 mg/mL。

圖4 LPP 對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.4 Effect of LPP on the glucose consumption of IR-HepG2 cells

用0.1～2.5 mg/mL 的LPP 分別作用于IR-HepG2細胞24、48、72 h，測定細胞存活率，評價LPP 在緩解胰島素抵抗時對IR-HepG2 細胞活性的影響，探究LPP 的細胞毒性作用，結(jié)果見圖5。

圖5 LPP 對IR-HepG2 細胞存活率的影響Fig.5 Effect of LPP on survival rate of IR-HepG2 cells

從圖5 中可以看出，各組細胞存活率均在80%以上，且樣品組隨LPP 濃度的降低細胞存活率上升，呈現(xiàn)劑量依賴性，說明高濃度的LPP 對IR-HepG2細胞有一定的抑制作用。整體趨勢表明24 h 時細胞存活率高于其他時間組，72 h 時細胞存活率最低。24 h 可作為LPP 改善胰島素抵抗干預(yù)的最佳時間，因此后續(xù)試驗設(shè)置培養(yǎng)時間為24 h[26]。

2.3 LPP 對IR-HepG2 細胞糖代謝途徑的影響

2.3.1 LPP 對IR-HepG2 細胞糖原含量的影響 人體內(nèi)糖原主要分為肝糖原和肌糖原，肝臟通過分解、合成肝糖原來調(diào)節(jié)血糖，維持機體血糖平衡[27]。根據(jù)上述試驗結(jié)果，LPP 組設(shè)置濃度為0.1、0.5、1 mg/mL，培養(yǎng)24 h 后，測定LPP 對IR-HepG2 細胞中糖原含量的影響，以此來探究LPP 緩解胰島素抵抗調(diào)節(jié)血糖平衡的能力，結(jié)果見圖6。

圖6 LPP 對IR-HepG2 細胞中糖原含量的影響Fig.6 Effect of LPP on the glycogen content in IR-HepG2 cells

由圖6 可知，在培養(yǎng)24 h 后，空白對照組的糖原含量最高，模型組糖原含量最低，比空白對照組降低15.2%（P＜0.001）；陽性對照組的糖原含量比模型組提高了14.7%（P＜0.001），LPP 組的糖原含量均顯著（P＜0.001）高于模型組，且從0.1 mg/mL 到1 mg/mL分別高了11.6%、14.1%和10.5%；當LPP 濃度為0.5 mg/mL 時，糖原含量與陽性對照組差異不顯著（P＞0.05）。該結(jié)果表明LPP 在一定濃度范圍內(nèi)能夠通過促進IR-HepG2 細胞糖原合成，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用。KIM 等[28]和MALGORZATA 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，綠茶多酚和木瓜多酚通過促進HepG2 細胞糖原合成，調(diào)節(jié)PEPCK 的表達，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用，與LPP 調(diào)節(jié)糖代謝的作用方式一致。

2.3.2 LPP 對IR-HepG2 細胞HK、PK 活性的影響糖酵解是糖在無氧條件下發(fā)生的氧化反應(yīng)，是體內(nèi)葡萄糖分解代謝的關(guān)鍵途徑，催化糖酵解反應(yīng)的一系列酶都存在于細胞質(zhì)內(nèi)，因此催化反應(yīng)也在細胞質(zhì)內(nèi)進行，HK 和PK 是糖酵解中的兩個關(guān)鍵限速酶，如果能提高這兩個酶的活性就可以降低血糖濃度[30]。圖7、圖8 為LPP 對IR-HepG2 細胞中HK、PK 活性影響的測定結(jié)果。

圖7 LPP 對IR-HepG2 細胞中HK 活性的影響Fig.7 Effect of LPP on the activity of HK in IR-HepG2 cells

圖8 LPP 對IR-HepG2 細胞中PK 活性的影響Fig.8 Effect of LPP on the activity of PK in IR-HepG2 cells

由圖7、圖8 可知，模型組HK 和PK 的酶活力分 別 為 27.61±0.18 nmol/min/mg prot 和 96.77±1.34 U/g prot，均顯著低于空白對照組（P＜0.001）；陽性對照組與模型組相比，HK 和PK 的酶活性分別提高了46.8%和16.9%；與模型組相比，LPP 樣品組從0.1 mg/mL 到1 mg/mL HK 的活性分別提高了38.1%、44.8%和36.6%，PK 的活性分別提高13.7%、16.6%和13.5%，由此可以看出0.1～1 mg/mL 的LPP 能夠顯著提高IR-HepG2 細胞HK 和PK 活性（P＜0.001），且在濃度LPP 為0.5 mg/mL 時效果最好。該結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)LPP 能夠提高提高糖酵解關(guān)鍵酶活性，加速葡萄糖的利用，從而達到調(diào)節(jié)糖代謝的作用。符群等[31]的研究發(fā)現(xiàn)雞樹條莢蒾果多酚可提高IR-HepG2 細胞的HK、PK 活性，加快糖酵解，從而減少細胞內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生，雖然雞樹條莢蒾果多酚與檸檬皮多酚組成不盡相同，但是其調(diào)節(jié)糖代謝的作用途徑相同。

2.3.3 LPP 對IR-HepG2 細胞PEPCK、G6Pase 活性的影響 糖異生是體內(nèi)的生糖反應(yīng)，能將乳酸、丙酮酸、氨基酸和甘油等非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖，糖異生主要是在肝臟進行，小部分在腎臟進行，因此通過抑制PEPCK 和G6Pase 這兩種酶的活性可以抑制非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而降低血糖濃度，調(diào)節(jié)血糖平衡[32]。圖9、圖10 為LPP 對IR-HepG2 細胞中PEPCK、G6Pase 活性影響的測定結(jié)果。

由圖9、圖10 可知，模型組PEPCK 和G6Pase的酶活力分別為13.94±0.30 和43.87±0.78 IU/g prot，均顯著高于空白對照組（P＜0.001），說明此時IRHepG2 細胞的糖異生反應(yīng)高于正常細胞，表現(xiàn)出了糖代謝紊亂現(xiàn)象；陽性對照組與模型組相比，PEPCK和G6Pase 的活性分別降低了42.5%和24.3%；與模型組相比，LPP 樣品組從0.1～1 mg/mL PEPCK 的活性分別降低了33.1%、41.2%和18.6%，G6Pase 的活性分別降低了20.2%、22.8%和13.3%；0.5 mg/mL的LPP 組與陽性對照組相比PEPCK 和G6Pase 的活性差異均不顯著（P＞0.05）。該結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)LPP 能夠通過抑制糖異生關(guān)鍵酶的活性，減少生糖反應(yīng)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用，且當濃度為0.5 mg/mL 時與0.05 mg/mL 的二甲雙胍具有相似效果。ELUMALAI[33]和JU 等[34]研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷可以增加糖尿病大鼠和小鼠的HK 活性，降低G6Pase 活性，并能改善其肝組織中的糖原含量，這一結(jié)果與本文結(jié)論相符，據(jù)此可以推測LPP能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝作用可能與其中的橙皮苷成分密切相關(guān)。

圖9 LPP 對IR-HepG2 細胞中PEPCK 活性的影響Fig.9 Effect of LPP on the activity of PEPCK in IR-HepG2 cells

3 結(jié)論

本試驗利用HPLC-QTOF-MS 對檸檬皮多酚進行初步成分分析，共分析出12 種物質(zhì)，分別為香草酸、新綠原酸、葒草素、山奈黃苷、圣草枸櫞苷、野漆樹苷、Chrysoeriol-7-O-（2'-O-mannopyranosyl）allopyranoside、金雀花素、地奧司明、橙皮苷、4-甲基-7-乙酰氧基香豆素-β-D-葡萄糖醛酸苷和諾米林；進一步通過測定檸檬皮多酚對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響，發(fā)現(xiàn)在前48 h 內(nèi)濃度為0.1～2 mg/mL的LPP 組與模型組比較可以顯著提高（P＜0.05）IRHepG2 細胞的葡萄糖消耗量，緩解胰島素抵抗狀態(tài)，通過測定LPP 作用后IR-HepG2 細胞的糖原含量、HK、PK、PEPCK 和G6Pase 的活性來研究LPP 調(diào)節(jié)糖代謝的途徑，結(jié)果表明，檸檬皮多酚能夠顯著提高IR-HepG2 細胞的糖原含量和糖酵解關(guān)鍵限速酶HK 和PK 的酶活力（P＜0.001），顯著降低糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 和G6Pase 的活性（P＜0.001），從而達到調(diào)節(jié)血糖的作用，且當LPP 濃度為0.5 mg/mL 時，其提高細胞糖原含量、促進糖酵解、抑制糖異生的效果最好。本試驗為后續(xù)進行體內(nèi)試驗提供了數(shù)據(jù)支持，為今后開發(fā)成功能性產(chǎn)品或添加劑提供了可靠依據(jù)。