H型血管在骨質(zhì)疏松癥中的研究進(jìn)展

張志秀 劉靜 曾佩蕓 錢子冰 張琦

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨吸收速度大于骨形成導(dǎo)致退變的疾病，具有骨微結(jié)構(gòu)退化、骨密度(BMD)低的特點(diǎn)，常伴有骨折、疼痛和身體限制，給人類帶來(lái)巨大的痛苦[1-3]。據(jù)估計(jì)，全世界有2億女性患有此病，每年造成超過(guò)890萬(wàn)例骨折，50歲以上的中國(guó)人每年導(dǎo)致約68.7萬(wàn)人髖部骨折[3]。雖然在針對(duì)該病的機(jī)制方面取得了進(jìn)展，但目前的治療效果仍然不太理想[1]。有研究[4]報(bào)道在小鼠骨骼系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)新型毛細(xì)血管亞型，其具有特殊的形態(tài)、功能和分子特性。這些血管具有特定的結(jié)構(gòu)，可參與骨內(nèi)血管的生長(zhǎng)，維持血管周圍骨祖細(xì)胞的數(shù)量，并結(jié)合血管生成與骨生成[5]。研究發(fā)現(xiàn)老年動(dòng)物骨中血管和骨祖細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，這在藥理學(xué)上是可逆的，可以恢復(fù)骨量。因此，本文就H型血管在骨質(zhì)疏松癥中的研究進(jìn)展做一綜述，以進(jìn)一步為骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展提供新的研究目標(biāo)。

1 H型血管的結(jié)構(gòu)及功能

血管是由多種類型的細(xì)胞組成的，其中內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs) 在血管形成、血管生成和止血過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[6]。骨血管內(nèi)排列著分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有特殊的形態(tài)、功能和分子特性。Kusumbe等[4]在小鼠生長(zhǎng)板附近的小梁骨和皮質(zhì)骨中以及在骨膜和骨內(nèi)膜表面發(fā)現(xiàn)了一種特殊的血管亞型，根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物的差異，分為H型血管和L型血管。H型血管中血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(CD31)和內(nèi)粘蛋白(endomucin，EMCN)高表達(dá)，L型血管中CD31和EMCN低表達(dá)。H型血管位于干骺端生長(zhǎng)板附近，同時(shí)位于骨干的骨膜和內(nèi)層及關(guān)節(jié)軟骨下，周圍聚集著著大量的 Osterix+骨祖細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生特定因子進(jìn)而刺激骨髓中骨祖細(xì)胞增殖和分化，積極引導(dǎo)骨形成。研究發(fā)現(xiàn)H型血管和骨祖細(xì)胞的數(shù)量與年齡呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，隨年齡增加而減少，為老年性骨質(zhì)疏松癥的診治提供了新的措施[4,6-8]。隨后王亮等[9]研究中，他們通過(guò)收集股骨近端轉(zhuǎn)子間骨折并行近端髓內(nèi)釘固定術(shù)后患者的骨標(biāo)本，證實(shí)人骨組織中也存在這種血管。后來(lái)，Gao等[10]從髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭中分離血管內(nèi)皮細(xì)胞，使用免疫熒光染色檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31和EMCN的定位，一周左右在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)融合后細(xì)胞形成單層，呈束狀排列，輪生狀，生長(zhǎng)呈貼壁抑制，細(xì)胞多呈短梭形、多角形和鵝卵石樣形態(tài)特征，證實(shí)在人股骨頭內(nèi)存在H亞型血管內(nèi)皮細(xì)胞(HSVECs)。經(jīng)對(duì)照組、骨質(zhì)減少組和骨質(zhì)疏松組的比較顯示，H型血管與骨量減少的關(guān)系緊密，認(rèn)為人類H型血管的密度是骨量減少的早期標(biāo)記，可通過(guò)生成H型血管來(lái)增加骨量[11-12]。

2 參與H型血管生成與成骨的細(xì)胞因子

2.1 破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分泌的血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)

PDGF- BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)是PDGF家族中參與趨化和有絲分裂，在促進(jìn)各種間充質(zhì)細(xì)胞遷移、增殖和分化以促進(jìn)血管生成和成骨過(guò)程中起關(guān)鍵作用的因子[13-15]。Xie等[16]在OVX(去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型)小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CD31hiEmcnhi血管減少，而破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分泌的PDGF-BB可以誘導(dǎo)H型血管(CD31hiEmcnhi)血管生成，刺激骨形成，他們認(rèn)為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞是骨髓和外周血中PDGF-BB的主要來(lái)源,同時(shí)敲除組織蛋白酶K(Ctsk)或注射其抑制劑可有效增加PDGF-BB的水平，Ctsk抑制劑還可增加OVX骨質(zhì)疏松小鼠的血管生成和骨生成[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)人員給3個(gè)月大的OVX小鼠體內(nèi)注射SHP-2 抑制劑(NSC-87877)，發(fā)現(xiàn)NSC-87877可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松小鼠骨髓中CD31hiEmcnhi血管和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)量增加，PDGF-BB水平升高。體外實(shí)驗(yàn)也表明，NSC-87877可防止破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合，增加PDGF-BB的產(chǎn)生，增強(qiáng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞促血管生成能力[18]。Jie等[19]通過(guò)給OVX小鼠體內(nèi)灌Harmine乳劑，2個(gè)月后取骨標(biāo)本進(jìn)行μCT、HE、免疫組化和免疫熒光分析，評(píng)價(jià)骨量、成骨和破骨活性以及H型血管數(shù)量，發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠經(jīng)Harmine乳劑處理后，骨髓中PDGF-BB水平升高，骨中H型血管明顯增多，認(rèn)為Harmine乳劑可能通過(guò)抑制破骨細(xì)胞形成和促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞源性PDGF-BB的分泌來(lái)促進(jìn)血管生成。后期Shangguan等[20]發(fā)現(xiàn)地塞米松可以通過(guò)抑制PDGF-BB下游的PDGFFRβ/FAK信號(hào)通路誘導(dǎo)H血管發(fā)育不良，增加骨質(zhì)疏松的易感性。

2.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

VEGF(尤其是VEGF-A)作為一種趨化分子，其分泌是成骨和血管生成偶聯(lián)所必需的,通過(guò)將內(nèi)皮細(xì)胞吸引到骨組織中，從而調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化與功能，參與骨重建[21-23]。有研究利用特異性缺失VEGFA轉(zhuǎn)基因小鼠的成骨細(xì)胞，在通過(guò)膜內(nèi)成骨發(fā)生修復(fù)的區(qū)域，血管生成和成骨耦聯(lián)需要最佳水平的VEGF，證明了VEGF在炎癥階段可趨化巨噬細(xì)胞募集和血管生成反應(yīng)，猜測(cè)其可能在這一過(guò)程中起旁分泌的功能。此外，另有研究[24-25]顯示肥大的軟骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞來(lái)源的VEGF刺激破骨細(xì)胞和血管的募集，并在骨膜軟骨內(nèi)成骨階段促進(jìn)修復(fù)部位的軟骨吸收。PDGF-BB可以增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞中的VEGF信號(hào)，以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞管的形成[17]。但是，VEGF調(diào)控H型血管生成與骨生成具體機(jī)制還有待研究，同時(shí)骨質(zhì)疏松治療可能會(huì)影響循環(huán)中VEGF的水平，因此，需要進(jìn)一步研究以確定VEGF是否在骨質(zhì)疏松中起因果作用。

2.3 缺氧誘導(dǎo)因子 HIF-1α(hypoxia-induced factor 1α)

HIF-1α是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)氧變化的反應(yīng)，并調(diào)控生理性以及病理性新生血管的生成。內(nèi)皮細(xì)胞中缺氧信號(hào)導(dǎo)致H型血管數(shù)量增加，從而促進(jìn)軟骨內(nèi)血管生成和成骨過(guò)程[14,26]。Kusumbe等[4]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)H型和L型兩種類型的骨血管內(nèi)皮細(xì)胞，這兩種類型血管內(nèi)皮細(xì)胞在HIF-1α和表面標(biāo)志物的表達(dá)水平上存在差異，HIF-1α在H型血管內(nèi)皮細(xì)胞中明顯表達(dá)，定位于軟骨-骨交界處附近，還表現(xiàn)出CD31hiEmcnhi的強(qiáng)烈表達(dá)，而L型內(nèi)皮細(xì)胞定位于骨干的竇狀血管，以CD31和EMCN低表達(dá)為特征。同時(shí)發(fā)現(xiàn)幼鼠體內(nèi)HIF-1α在H型內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，且表達(dá)水平隨著幼鼠年齡的增長(zhǎng)而降低，證明年齡依賴性的骨量丟失與H型內(nèi)皮細(xì)胞的減少有關(guān)。ECs特異性分泌的HIF-1α的缺失導(dǎo)致骨祖細(xì)胞顯著減少，并伴隨著骨小梁形成的減少[27]。Wang等[11]通過(guò)對(duì)去卵巢小鼠(OVX)腹腔注射去鐵胺(DFO)4周后發(fā)現(xiàn)H型血管和骨祖細(xì)胞的數(shù)量增加，DFO可抑制脯氨酰-4-羥化酶，從而增強(qiáng)HIF-1α的活性和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)血管生成信號(hào)上調(diào)，促進(jìn)血管生成和增加去卵巢小鼠H型血管，導(dǎo)致骨量顯著增加，有潛力作為理想靶點(diǎn)來(lái)治療骨質(zhì)疏松，誘導(dǎo)骨生成。

3 參與H型血管生成與成骨的其他因素

3.1 Notch信號(hào)通路調(diào)控H型血管的形成

Noch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和動(dòng)態(tài)平衡等過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。自從Dexter和Morgan發(fā)現(xiàn)了帶缺口翅膀的突變果蠅以來(lái)，已經(jīng)有大量的研究和動(dòng)物模型闡明了Notch信號(hào)的生理和病理作用。Notch受體及其配體是跨膜蛋白，通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間的物理作用啟動(dòng)其信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。人類有四種Notch受體(Notch1～4)和五種不同的Notch配體(JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4)[28]。Notch信號(hào)通路參與了骨骼細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和骨重塑，并且已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和體外進(jìn)行的研究中證實(shí)，對(duì)骨骼細(xì)胞的活動(dòng)和骨骼發(fā)育至關(guān)重要[14,29]。Ramasamy等[30]對(duì)小鼠體內(nèi)Notch信號(hào)進(jìn)行遺傳干擾后，發(fā)現(xiàn)小鼠不僅H型血管的形態(tài)與生長(zhǎng)受到損害，還會(huì)導(dǎo)致成骨障礙、長(zhǎng)骨變短、軟骨細(xì)胞突變、骨小梁缺失和骨量下降。給予重組Noggin(一種分泌型骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑)可恢復(fù)骨生長(zhǎng)和礦化、軟骨細(xì)胞成熟、小梁形成以及內(nèi)皮細(xì)胞特異性Notch信號(hào)途徑突變體中的骨祖細(xì)胞數(shù)量，證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞Notch信號(hào)活性可促進(jìn)骨內(nèi)H型血管形成和成骨。

3.2 低強(qiáng)度脈沖超聲促進(jìn)骨H型血管的形成

1983年，Xavier和Duarte首次使用低強(qiáng)度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)加速人體骨折修復(fù)過(guò)程[31]。此后，人們對(duì)LIPUS的效果進(jìn)行了大量的研究，最近，LIPUS作為骨折愈合的一種無(wú)創(chuàng)輔助治療方式已在臨床試驗(yàn)中報(bào)道，證據(jù)表明，LIPUS在治療骨折和延遲骨不愈合、修復(fù)肌腱和韌帶以及改善脊柱融合方面是有效的。此外，LIPUS對(duì)四肢骨折有很強(qiáng)的療效，可以增加軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的產(chǎn)量，加速骨痂的形成[32]。其次，研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可以加速脊柱融合，使H型血管增多。對(duì)40只雄性SD大鼠進(jìn)行單節(jié)段單側(cè)脊柱后關(guān)節(jié)融合術(shù)，隨機(jī)分為L(zhǎng)IPUS組和對(duì)照組，各20只，LIPUS組術(shù)后第三天開(kāi)始使用LIPUS，術(shù)后兩周發(fā)現(xiàn)兩組中均出現(xiàn)CD31hi微血管，血管稀疏，LIPUS組高于對(duì)照組，術(shù)后4周，LIPUS組和對(duì)照組的平均血管密度分別為(3.22±0.56)%和(1.81±0.60)%(P<0.01)，LIPUS組與對(duì)照組相比，Emcnhi微血管明顯增多，證實(shí)LIPUS能顯著增加脊柱融合過(guò)程中的成骨細(xì)胞數(shù)量，這一過(guò)程與H型微血管生成增加有關(guān)[33]。Wu等[32]建立創(chuàng)傷性椎體骨折大鼠模型，術(shù)后采用LIPUS治療，術(shù)后4周采用X線攝片、計(jì)算機(jī)斷層掃描、三維重建等方法評(píng)價(jià)骨愈合情況，組織學(xué)分析評(píng)價(jià)成骨過(guò)程及與H型微血管的關(guān)系。LIPUS治療組與對(duì)照組相比，小梁網(wǎng)重塑良好，骨折處形成豐富的軟骨細(xì)胞、骨髓腔、骨小梁和H型微血管，證實(shí)低強(qiáng)度脈沖超聲可增加創(chuàng)傷性椎體骨折模型中軟骨、成骨細(xì)胞以及H型微血管的生成，促進(jìn)創(chuàng)傷性椎體骨折愈合。

3.3 MiRNAs調(diào)控血管生成與成骨

MiRNAs是一種進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼小RNA片段，長(zhǎng)度為20～22個(gè)堿基對(duì)，參與真核基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)miRNA可以靶向調(diào)控多個(gè)基因，因此基于miRNA的基因治療是一種發(fā)展迅速的疾病治療策略，在治療骨質(zhì)疏松癥方面有很大的潛力[34]。此外，Yang等[35]發(fā)現(xiàn)miR-497～195群在CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞中豐富度高，并隨著年齡的增長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞miR-497～195群缺失的小鼠CD31hiEmcnhi血管較少，骨量較低。相反，在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-497～195群可以減輕與年齡相關(guān)的CD31hi血管減少和骨量丟失。MIR-497～195群分別通過(guò)靶向F-box和WD-40結(jié)構(gòu)域蛋白(Fbxw7)和具有跨膜結(jié)構(gòu)域的脯氨酰4-羥化酶(P4HTM)來(lái)維持內(nèi)皮Notch活性和HIF-1a的穩(wěn)定性，研究表明miR-497～195群可以調(diào)控血管生成和成骨，可能成為治療老年性骨質(zhì)疏松癥的新措施。

3.4 E型內(nèi)皮細(xì)胞

近年來(lái)，Langen等[36]報(bào)道了一種強(qiáng)烈支持成骨細(xì)胞系的特殊內(nèi)皮細(xì)胞亞型，其存在于胚胎以及出生后早期長(zhǎng)骨，稱為E型，E型內(nèi)皮細(xì)胞可分化為H型內(nèi)皮細(xì)胞，與H型毛細(xì)血管相比，E型血管與Osterix+骨祖細(xì)胞的相關(guān)性更強(qiáng)，細(xì)胞基質(zhì)信號(hào)通過(guò)指定發(fā)育成骨過(guò)程中的骨內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)骨生成。

3.5 鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZEB1

鋅指E盒結(jié)合同源框1(ZEB1)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可觸發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)程序，對(duì)正常發(fā)育和病理狀態(tài)至關(guān)重要[37]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZEB1在人和小鼠骨內(nèi)的H型血管內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞特異性缺失ZEB1會(huì)損害骨內(nèi)CD31hi血管的形成，導(dǎo)致成骨減少。從機(jī)制上講，ZEB1缺失減少了DLL4和Notch1啟動(dòng)子上的組蛋白乙酰化，從而抑制了控制骨血管生成和成骨的Notch信號(hào)。ZEB1在骨質(zhì)疏松癥小鼠和人類骨骼內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)下降，給骨質(zhì)疏松小鼠注射ZEB1包裝的脂質(zhì)體可以恢復(fù)受損的骨骼內(nèi)皮Notch活性，進(jìn)而促進(jìn)血管生成依賴性的成骨，改善骨量丟失，藥物逆轉(zhuǎn)低ZEB1/Notch信號(hào)可能通過(guò)促進(jìn)血管生成依賴性骨形成對(duì)骨質(zhì)疏松患者發(fā)揮治療作用[38]。

4 小結(jié)與展望

骨是一種高度血管化的結(jié)締組織，骨骼血管在骨發(fā)育、再生和重建過(guò)程中起著重要作用[39-40]。在小鼠和人體骨骼系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)H型血管，顯示H型血管生成與骨生成存在耦合，認(rèn)為H型血管的密度是骨量減少的早期標(biāo)記，可作為誘導(dǎo)H型血管來(lái)改善骨質(zhì)量的新措施[4,11,30]。目前骨質(zhì)疏松癥的治療主要集中于靶向抑制破骨細(xì)胞骨吸收或合成代謝療法刺激成骨細(xì)胞骨形成，由于它們的生物利用度有限和其他有害的影響，治療效果不是很理想。隨著我國(guó)人口逐漸進(jìn)入老齡化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也在逐漸升高，成為公共衛(wèi)生一大難題。相信在未來(lái)，改善H型血管在骨量丟失方面的研究將會(huì)為骨質(zhì)疏松癥的診治提供一條很有前途的研究方向。