慢性阻塞性肺疾病動(dòng)物模型研究進(jìn)展

曾德優(yōu)，張六一，肖 創(chuàng)，王略力，黃 蓉，方 雁，，杜曉華，Yusef Absi(約旦)，陳 晨， 楊為民

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650031)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見(jiàn)的、可以預(yù)防和治療的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)呼吸癥狀和氣流受限為特征，通常是由于暴露于有毒顆?；驓怏w引起的氣道和肺泡病變所致[1]。臨床上COPD分為穩(wěn)定期和急性加重期(Acute exacerbation of COPD，AECOPD)，病毒和細(xì)菌感染是導(dǎo)致COPD急性加重的主要誘因。AECOPD患者全身炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，目前應(yīng)用最廣泛的治療藥物是糖皮質(zhì)激素[2]，其在降低COPD患者住院率、病死率和疾病嚴(yán)重程度方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。

1 模型動(dòng)物

COPD動(dòng)物模型的肺部解剖結(jié)構(gòu)應(yīng)與人類相似，以便更好模擬人類COPD的病理生理特征。目前建立COPD模型的動(dòng)物種類繁多，例如大鼠、小鼠、犬、羊、家兔、猴子、小型豬等。其中嚙齒類小動(dòng)物是最常用的COPD、AECOPD模型動(dòng)物。大小鼠生命周期短，品系多，易飼養(yǎng)，生長(zhǎng)發(fā)育快，性情較溫馴，飼養(yǎng)繁殖成本較低；其生理特征、病理特征與人類有很多相似[4-5]。其優(yōu)點(diǎn)有基因背景明確、可操作性好、飼養(yǎng)和維護(hù)費(fèi)用低、節(jié)省人力和物力等[6]。且大多數(shù)選擇SPF級(jí)Wistar大鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠、昆明小鼠等作為復(fù)制COPD、AECOPD疾病模型的動(dòng)物。

2 常用COPD大小鼠模型造模方法

2.1 單因素誘導(dǎo)模型

2.1.1 香煙煙霧模型：香煙煙霧(Cigarette smoke，CS)的刺激可誘導(dǎo)氣道基因表達(dá)的改變，還會(huì)增強(qiáng)肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起肺部的局部炎癥和小氣道重塑[7-8]。Xiao等[9]通過(guò)長(zhǎng)期CS暴露28周的方法成功建立了COPD大鼠模型。Beckett等[10]采用CS口鼻暴露小鼠8周后出現(xiàn)氣道重塑、肺氣腫和肺功能下降。CS暴露誘導(dǎo)建立的COPD大小鼠模型符合COPD的許多疾病特征，但不同的動(dòng)物對(duì)CS的敏感程度不一樣[11]；此外，CS暴露的方法和時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致COPD大小鼠模型的誘導(dǎo)結(jié)果不一致[8]。其中，采用單純CS口鼻暴露小鼠八周以上的方法效果更佳，且暴露時(shí)間還可適當(dāng)延長(zhǎng)。

2.1.2 脂多糖模型：脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是效應(yīng)較強(qiáng)的致熱源革蘭陰性菌內(nèi)毒素的活性成分和特有結(jié)構(gòu)[12]，可引起氣道上皮損傷，誘發(fā)氣道炎癥。常以氣管內(nèi)滴注、滴鼻吸入的方式來(lái)誘導(dǎo)COPD模型，且通過(guò)反復(fù)滴注可模擬反復(fù)感染[13]。LPS導(dǎo)致的肺部病理生理學(xué)變化與COPD模型的表現(xiàn)很相似[14]。有研究表明[15]，單獨(dú)采用LPS暴露的方法可成功誘導(dǎo)建立COPD動(dòng)物模型。LPS誘導(dǎo)建立的COPD大小鼠模型的病理變化符合COPD的病理特征，且造模時(shí)間短，方法簡(jiǎn)便易行[16]，其中以氣管內(nèi)滴注的方式來(lái)復(fù)制COPD動(dòng)物模型效果更好。

2.1.3 蛋白酶模型：蛋白酶(Protease)是生物體內(nèi)的一類酵素(酶)，以豬胰彈性蛋白酶應(yīng)用最廣泛；蛋白酶誘導(dǎo)建立COPD動(dòng)物模型的方法是通過(guò)模擬COPD發(fā)病時(shí)蛋白酶/抗蛋白酶失衡機(jī)制[17]；造模方法主要有氣管內(nèi)滴入、霧化吸入、氣管切開(kāi)注射等。以蛋白酶誘導(dǎo)建立的COPD動(dòng)物模型表現(xiàn)與COPD臨床患者癥狀相似[18]。Ueno等[19]將豬胰彈性蛋白酶滴入小鼠氣管，隨時(shí)間的增加，小鼠肺泡破壞程度和炎癥反應(yīng)加重。該法造模簡(jiǎn)單迅速，動(dòng)物感染少，模型病變程度可控，但是蛋白酶作用的發(fā)揮受動(dòng)物品種、病理、生理機(jī)制等因素的影響[20]。

2.1.4 呼吸道病毒感染模型：呼吸道炎癥的誘因包括呼吸道病毒、細(xì)菌等。有研究表明[21]，COPD患者對(duì)甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)易感性會(huì)增加。IAV感染后的模型動(dòng)物肺部及全身炎癥的表達(dá)水平升高、支氣管擴(kuò)張劑的反應(yīng)水平降低[22]。通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行氣道銅綠假單胞菌反復(fù)感染的方法建立的COPD大鼠模型表現(xiàn)出明顯的COPD樣病理學(xué)變化[23]。呼吸道感染雖然符合COPD臨床誘因，但是要求維持合適的感染量[24]。通過(guò)氣管內(nèi)滴注病毒造成呼吸道感染的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作及環(huán)境要求較高，但是模型效果較好。

2.1.5 大氣污染物模型：英國(guó)生物樣本庫(kù)的一項(xiàng)基于人群研究證實(shí)了大氣污染與COPD患病率增加有關(guān)[25]。有研究表明[26]臭氧、二氧化氮、二氧化硫等大氣污染物的濃度和COPD的發(fā)病率呈明顯的正相關(guān)性。Gao等[27]通過(guò)臭氧暴露C57BL/6小鼠的方法成功建立了COPD模型。Wu等[28]研究發(fā)現(xiàn)高濃度PM2.5會(huì)降低肺功能通氣指標(biāo)，抑制人的肺功能。通過(guò)臭氧、PM2.5等大氣污染物誘導(dǎo)復(fù)制COPD大小鼠模型的方法包括氣管內(nèi)滴注、吸入等。

2.1.6 基因調(diào)控模型：COPD是一種多基因遺傳易感性疾病，有研究表明[29]，在造成COPD疾病發(fā)作的因素中，易感性遺傳基因是一個(gè)重要的因素。Richmond等[30]對(duì)小鼠特定基因進(jìn)行敲除，影響小鼠氣道表面分泌型免疫球蛋白A的表達(dá)，成功誘導(dǎo)出了小鼠COPD疾病模型。Borel等[31]運(yùn)用第三代基因編輯技術(shù)成功復(fù)制出了小鼠COPD疾病模型?；蛘{(diào)控的方法是近年來(lái)興起的一種新方法，能為COPD發(fā)病機(jī)制、疾病模型建立及相關(guān)研究提供新的研究方向。

2.2 復(fù)合因素誘導(dǎo)模型

2.2.1 香煙煙霧暴露聯(lián)合脂多糖模型：CS暴露聯(lián)合LPS的方法是目前國(guó)內(nèi)外最常用的COPD造模方法。有研究表明[32]，CS暴露聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的COPD動(dòng)物模型與人類COPD的病理表現(xiàn)更相似，造模成功后的動(dòng)物支氣管管腔變形，肺泡壁變薄斷裂，管壁周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Shin等[33]對(duì)小鼠進(jìn)行CS暴露7 d，第4天氣管內(nèi)滴入LPS，結(jié)果表明小鼠肺部生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。Lee等[34]的研究通過(guò)煙熏和內(nèi)毒素聯(lián)合的方法建立COPD動(dòng)物模型，結(jié)果顯示該方法復(fù)制的模型動(dòng)物炎癥反應(yīng)比單純煙熏法或單純內(nèi)毒素法較明顯。張卓紅等[35]采用CS暴露與氣管內(nèi)注射LPS建立COPD大鼠模型，結(jié)果顯示模型組造模過(guò)程中第0.3 s用力呼氣容積、第0.3 s用力呼氣容積與用力肺活量的比值均低于對(duì)照組。應(yīng)用香煙煙霧暴露聯(lián)合脂多糖法建立COPD大小鼠模型，可以大大縮短COPD的造模時(shí)間，提高動(dòng)物模型的穩(wěn)定性，但是該造模方法影響因素較多，LPS給入的時(shí)間及劑量各異。

2.2.2 香煙煙霧暴露聯(lián)合蛋白酶模型:Saluja等[36]的研究采用人唾液彈性蛋白酶聯(lián)合香煙煙霧提取物氣管內(nèi)滴注大鼠，結(jié)果提示大鼠肺部結(jié)節(jié)白細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡增大，表明COPD大鼠模型基本復(fù)制成功。CS暴露聯(lián)合氣管內(nèi)注入蛋白酶的方法可以減少蛋白酶的用量，縮短造模的時(shí)間；但CS暴露聯(lián)合蛋白酶模型也存在一些缺陷，如氣管內(nèi)滴注蛋白酶時(shí)需要對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行氣管切開(kāi)，加之煙霧暴露的過(guò)程，易造成模型動(dòng)物創(chuàng)傷難以恢復(fù)甚至誘發(fā)感染。

2.2.3 香煙煙霧暴露聯(lián)合細(xì)顆粒物(PM2.5)模型:大氣污染物中的主要成分PM2.5能滲透到肺泡引起明顯的炎癥和氧化應(yīng)激等反應(yīng)[37]。Gu等[38]將小鼠暴露于CS和PM2.5，成功復(fù)制出了COPD小鼠模型。Chu等[39]應(yīng)用CS聯(lián)合PM2.5懸浮微粒吸入暴露的方法誘導(dǎo)小鼠模型，結(jié)果顯示模型小鼠肺部出現(xiàn)明顯的COPD病理學(xué)改變，提示COPD小鼠模型復(fù)制基本成功。雖然該方法目前使用不廣泛，但就目前國(guó)內(nèi)吸煙人數(shù)的激增和PM 2.5污染形勢(shì)愈發(fā)地嚴(yán)峻，以此法建立COPD動(dòng)物模型的研究具有一定的價(jià)值。

2.2.4 香煙煙霧暴露聯(lián)合流感病毒模型:目前COPD的發(fā)生危險(xiǎn)因素眾多，且機(jī)制尚未明確,呼吸道病毒的感染也是COPD惡化及COPD急性加重期發(fā)生的重要因素。AECOPD患者全身炎癥反應(yīng)加強(qiáng)，臨床上常用的治療藥物一般為糖皮質(zhì)激素和抗生素[2,40]。但是，糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期吸入和多種抗菌藥物聯(lián)合使用與COPD患者合并感染性肺炎的發(fā)生有密切關(guān)系[41]。有研究者使用常見(jiàn)的流感病毒在C57小鼠CS暴露20周后進(jìn)行感染，發(fā)現(xiàn)小鼠氣道中TNF-α、IL-6等表達(dá)增加,炎癥急劇加重[42]。Xiao等[43]通過(guò)CS暴露18周聯(lián)合H1N1病毒感染C57BL/6 J雄性小鼠的方法成功建立了AECOPD小鼠模型。諸多研究表明,CS暴露聯(lián)合病毒感染對(duì)大小鼠COPD的發(fā)生發(fā)展有協(xié)同促進(jìn)作用。

2.2.5 香煙煙霧暴露聯(lián)合細(xì)菌感染模型:COPD急性加重期的發(fā)病因素主要是細(xì)菌或病毒感染。有研究者[44]在香煙煙霧暴露SD大鼠90 d后，使用醫(yī)院獲得性肺炎常見(jiàn)的致病菌銅綠假單胞菌和社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌肺炎鏈球菌進(jìn)行氣管內(nèi)滴注，結(jié)果顯示銅綠假單胞菌組、肺炎鏈球菌組大鼠肺組織病理改變明顯加重，肺組織勻漿培養(yǎng)為陽(yáng)性，提示AECOPD大鼠模型成功建立。Huang等[45]在C57BL/6J小鼠連續(xù)香煙煙霧暴露8周的過(guò)程中，每5 d 1次經(jīng)鼻吸入0.1 ml的肺炎克雷伯菌液(6×108CFU/ml)成功建立小鼠AECOPD模型。采用香煙煙霧聯(lián)合氣管內(nèi)滴注細(xì)菌的方法操作簡(jiǎn)便、動(dòng)物創(chuàng)傷較小，能較好的模擬AECOPD模型；而感染細(xì)菌采用滴鼻吸入的方法，動(dòng)物吸入細(xì)菌混懸液的體積難以精準(zhǔn)定量。

3 結(jié) 語(yǔ)

慢性阻塞性肺疾病是以慢性呼吸系統(tǒng)癥狀、肺功能損害、肺氣腫等為特征的一種臨床綜合征[46]，其主要的危險(xiǎn)因素是吸煙,而細(xì)菌或病毒是AECOPD的主要誘因。AECOPD患者預(yù)后判斷指標(biāo)尤為重要，有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ與AECOPD患者的肺功能和預(yù)后情況明顯相關(guān),可作為判斷的可靠指標(biāo)。人類COPD病因及機(jī)制等比較復(fù)雜，盡管近年來(lái)對(duì)COPD、AECOPD動(dòng)物模型的研究不斷深入，但是大多數(shù)動(dòng)物模型僅能模擬輕度病理、生理改變，難以精準(zhǔn)復(fù)制。目前造模方法種類繁多，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且單一因素誘導(dǎo)建模耗時(shí)長(zhǎng)、成模效果較差，而采用多種因素聯(lián)合誘導(dǎo)建立COPD、AECOPD動(dòng)物模型的方法也越來(lái)越多，但是模型效果差異較大。香煙煙霧暴露聯(lián)合脂多糖氣管內(nèi)滴注誘導(dǎo)建立COPD大小鼠模型的方法可操作性較好、耗時(shí)較短、效果較為顯著。通過(guò)對(duì)多種COPD大小鼠動(dòng)物模型的造模方法概述，同時(shí)評(píng)價(jià)這些造模方法的一些優(yōu)缺點(diǎn)，可為COPD病理機(jī)制研究、新藥的研發(fā)及COPD動(dòng)物模型的建立提供了一定的參考價(jià)值和基礎(chǔ)。