徐鑫梅，杜 歡，易 歡，武鑫玥，馮 圖，蔣桂華，范 剛

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學(xué)技術(shù)篩選不同基原小檗皮品種鑒別的指標(biāo)性成分

徐鑫梅1，杜 歡1，易 歡1，武鑫玥1，馮 圖2*，蔣桂華1，范 剛3*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137

研究不同基原小檗皮藥材（甘肅小檗Schneid.、鮮黃小檗Maxim.、匙葉小檗Schneid.和刺紅珠Franch.）的整體化學(xué)成分差異，篩選品種鑒別的指標(biāo)性成分。采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）代謝組學(xué)技術(shù)，分析不同基原小檗皮藥材的整體化學(xué)成分，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）和方差分析篩選不同基原鑒別的化學(xué)標(biāo)志物。共鑒定了47個(gè)化學(xué)成分，包括24個(gè)生物堿類(lèi)、12個(gè)有機(jī)酸類(lèi)及其衍生物、5個(gè)糖類(lèi)及其衍生物，以及6個(gè)其他類(lèi)成分。篩選出藥根堿、四氫巴馬汀、蟾毒色胺內(nèi)鹽等12個(gè)化學(xué)標(biāo)志物。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，可有效闡明小檗皮不同基原藥材的化學(xué)成分差異，為其品種鑒別和質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

小檗皮；甘肅小檗；鮮黃小檗；匙葉小檗；刺紅珠；UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS；代謝組學(xué)；品種鑒定；化學(xué)標(biāo)志物；藥根堿；四氫巴馬汀；蟾毒色胺內(nèi)鹽

小檗皮為小檗科植物甘肅小檗Schneid.及其同屬多種植物的干燥莖皮或根皮[1]，是藏醫(yī)治療糖尿病及其并發(fā)癥的常用藥材。小檗皮為典型的多基原藏藥材，同屬多種植物均能入藥，課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)目前各藏醫(yī)院及藥材市場(chǎng)上使用的小檗皮主流品種為甘肅小檗Schneid.、鮮黃小檗Maxim.、匙葉小檗Schneid.和刺紅珠Franch.[2]。小檗皮基原的多樣性和混淆使用不利于市場(chǎng)監(jiān)管，也影響其質(zhì)量穩(wěn)定性和可控性。因此，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)篩選可鑒別小檗皮不同基原品種的化學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于其品種鑒定和質(zhì)量控制具有重要的意義。

近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛運(yùn)用于植物藥材的整體成分分析、品種鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)等研究中。超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）具有高分辨率、高靈敏度的方法學(xué)優(yōu)勢(shì)，特別適用于植物藥材多成分復(fù)雜體系的分析[3]。小檗皮藥材主要含有小檗堿、木蘭花堿、蟾毒色胺內(nèi)鹽等成分，課題組前期采用HPLC和1H-NMR技術(shù)定性定量分析了小檗皮藥材中的部分化學(xué)成分[4-5]，但仍然缺乏全面的定性表征。因此，本研究采用基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的代謝組學(xué)技術(shù)，從整體上對(duì)小檗皮不同基原藥材的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）和方差分析，篩選可鑒別不同基原小檗皮的化學(xué)標(biāo)志物，以期為小檗皮藥材的品種鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Q-ExactiveTMOrbitrap高分辨質(zhì)譜儀、VanquishTM超高液相色譜儀、Compound Discoverer 3.0工作站、Xcalibur 2.1工作站（美國(guó)Thermo-Fisher公司）；CQ-250型超聲波清洗器（上海必能信有限公司）；SartoriusBP121s型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器公司）。

1.2 試劑

對(duì)照品蟾毒色胺內(nèi)鹽、阿魏酸4--β--吡喃葡萄糖苷為本課題組自制，HPLC檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞99%；對(duì)照品木蘭花堿（批號(hào)M-026-181122）、小檗紅堿（批號(hào)X-061-181129）和去亞甲基小檗堿（批號(hào)Y-126-180426）均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；對(duì)照品藥根堿（批號(hào)Y-023-141201）、巴馬汀（批號(hào)H-015-150808）和小檗堿（批號(hào)Y-035-150818）均購(gòu)自四川賽因斯特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；色譜純甲醇、甲酸購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fisher公司；分析純甲醇購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；蒸餾水購(gòu)自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

本研究共收集21批小檗皮藥材，采用植物分類(lèi)學(xué)及課題組前期建立的DNA條形碼方法[2]，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)范剛教授鑒定為小檗科植物刺紅珠Franch.、甘肅小檗Schneid.、匙葉小檗Schneid.和鮮黃小檗Maxim.，具體信息見(jiàn)表1。

表1 小檗皮樣品信息

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取小檗皮粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，密塞，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻?yàn)V過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品蟾毒色胺內(nèi)鹽、阿魏酸4β吡喃葡萄糖苷、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗紅堿、小檗堿、去亞甲基小檗堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別制成質(zhì)量濃度為0.41、0.47、0.62、0.62、0.55、0.44、0.48、0.51 μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～20 min，5%～80% A；20～30 min，80%～95% A；30～35 min，95%～95% A；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

參照課題組前期建立的質(zhì)譜條件[6]。采用HESI離子源，正離子檢測(cè)模式，電噴霧電壓為＋3000 V；負(fù)離子檢測(cè)模式，電噴霧電壓為?3000 V；鞘氣體積流量為35 arb；輔助氣體積流量為10 arb；毛細(xì)管溫度為320 ℃；二級(jí)質(zhì)譜采用Full MS/dd-MS2掃描模式，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，掃描范圍100～1500。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0軟件中，對(duì)其進(jìn)行譜峰提取、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊及噪音信號(hào)去除等預(yù)處理。預(yù)處理后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息與mzClond和mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中精準(zhǔn)的相對(duì)分子質(zhì)量以及二級(jí)質(zhì)譜碎片離子對(duì)化合物進(jìn)行歸屬和鑒定。同時(shí)查閱ChemSpider、Pubchem、Scifinder等在線數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道檢索化合物可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和裂解碎片，對(duì)鑒定的成分進(jìn)行比對(duì)和驗(yàn)證，進(jìn)一步排除假陽(yáng)性結(jié)果。將預(yù)處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，對(duì)不同基原小檗皮進(jìn)行PCA以及PLS-DA分析，并采用單因素方差分析進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，運(yùn)用MetaboAnalyst 5.0軟件對(duì)化學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析，觀察差異成分在不同基原小檗皮藥材中的分布情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 小檗皮化學(xué)成分的鑒定

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照建立的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法對(duì)21批小檗皮樣品進(jìn)行分析。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息預(yù)處理后，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，并與文獻(xiàn)報(bào)道中的碎片離子信息進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，共鑒別了47個(gè)化學(xué)成分。小檗皮中主要含有氨基酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)等初級(jí)代謝產(chǎn)物，以及生物堿等次級(jí)代謝產(chǎn)物。其中包含24個(gè)生物堿類(lèi)成分，主要為異喹啉類(lèi)生物堿，如小檗堿、巴馬汀、藥根堿、小檗紅堿、去亞甲基小檗堿等；12個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分及其衍生物，如奎寧酸、哌啶酸、蘋(píng)果酸等；5個(gè)糖類(lèi)及其衍生物，包括-葡萄糖胺、葡萄糖酸、果糖、蔗糖和海藻糖，其他類(lèi)成分6個(gè)，包括焦谷氨酸、脯氨酸、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、刺五加苷E和lariciresinol 4-- glucoside。鑒定的化合物具體質(zhì)譜裂解信息見(jiàn)表2。

表2 小檗皮化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果

續(xù)表2

*表示與對(duì)照品比對(duì)鑒定

*It indicates the comparison and identification with the references

3.2 不同基原小檗皮的圖譜比較

取不同基原小檗皮樣品，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到不同基原小檗皮藥材在正、負(fù)離子模式下全掃描總離子流圖，見(jiàn)圖1。通過(guò)直觀分析，可以看出4個(gè)基原品種小檗皮藥材的整體化學(xué)成分輪廓大致相同，但其部分信號(hào)峰的強(qiáng)度不同，表明不同基原小檗皮的化學(xué)成分雖然相似，但成分在含量上有一定差異。

3.3 基于模式識(shí)別比較小檗皮不同基原藥材的化學(xué)成分差異

將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Compound Discoverer 3.0預(yù)處理后，將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行PCA分析，選擇標(biāo)度化方法為帕累托法，其PCA得分圖如圖2-A所示。結(jié)果顯示，匙葉小檗和甘肅小檗在t[2]軸上呈現(xiàn)明顯分離，刺紅珠、鮮黃小檗和甘肅小檗較為接近，3組散點(diǎn)交互存在，有部分重疊，沒(méi)有達(dá)到明顯分離。

為了消除樣品組內(nèi)差異的影響，進(jìn)一步采用PLS-DA方法進(jìn)行判別分析。由二維得分圖（圖2-B）可以看出，匙葉小檗和刺紅珠、甘肅小檗、鮮黃小檗得到明顯分離，而刺紅珠、甘肅小檗和鮮黃小檗仍存在少量重疊，不能得到明顯區(qū)分。此外，三維得分圖（圖2-C）展示了21個(gè)樣本的空間分布情況，不同基原小檗皮明顯聚集為4類(lèi)，小檗皮4種基原藥材在三維圖譜中得到了較為明顯分離，表明小檗皮不同品種間的化學(xué)成分存在一定的差異。

圖1 小檗皮4種基原的正(A)、負(fù)(B) 離子模式總離子流圖

圖2 不同基原小檗皮PCA得分圖(A)、PLS-DA二維得分圖(B)、三維得分圖(C)和PLS-DA載荷圖(D)

3.4 可鑒別小檗皮不同基原品種的指標(biāo)性成分篩選

為了篩選可鑒別小檗皮4種基原的化學(xué)標(biāo)志物，進(jìn)一步創(chuàng)建小檗皮的PLS-DA載荷圖（圖2-D）。由載荷圖可以看出，藥根堿、小檗堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、蟾毒色胺內(nèi)鹽、8-氧化小檗堿等成分可能是引起小檗皮不同品種間差異的主要成分。此外，采用預(yù)測(cè)變量重要性VIP對(duì)成分進(jìn)行表征。VIP值較大的被認(rèn)為是區(qū)分4種基原小檗皮的主要潛在化學(xué)標(biāo)志物。根據(jù)變量重要性篩選出VIP＞3的變量共16個(gè)，包括藥根堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、小檗堿、蟾毒色胺內(nèi)鹽、8-氧化小檗堿、巴馬汀、刺五加苷E、木蘭花堿、阿魏酸、去亞甲基小檗堿、oblongine、蟾毒色胺、海藻糖、去甲異紫堇定和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷。

由于PLS-DA無(wú)法確定觀察到的差異成分是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此需要采用方差分析進(jìn)一步驗(yàn)證。以各成分的歸一化峰面積為指標(biāo)，采用單因素方差分析評(píng)價(jià)這些成分在小檗皮4種基原間的差異是否具有顯著性。結(jié)果顯示，小檗皮4種基原藥材中藥根堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、蟾毒色胺內(nèi)鹽、8-氧化小檗堿、巴馬汀等12種成分存在顯著性差異（圖3）。因此，這12種成分為化學(xué)標(biāo)志物，可為小檗皮藥材的品種鑒別以及質(zhì)量控制提供參考。

*P＜0.05 **P＜0.01

3.5 指標(biāo)性成分的熱圖分析

為了更直觀觀察12個(gè)化學(xué)標(biāo)志物在小檗皮4種基原藥材中的分布情況，采用MetaboAnalyst 5.0對(duì)12個(gè)差異成分進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖中深紅棕色到深藍(lán)色顏色的變化反映了差異成分在小檗皮不同基原藥材中的分布情況，其中紅棕色越深代表該成分的相對(duì)含量越高，相反藍(lán)色越深則表示該成分的相對(duì)含量越低。結(jié)果表明，熱圖分析與方差分析結(jié)果呈現(xiàn)基本一致。從圖中可以看出匙葉小檗含有更多的藥根堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、蟾毒色胺內(nèi)鹽、阿魏酸和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷；甘肅小檗藥材中去亞甲基小檗堿、8-氧化小檗堿、海藻糖、巴馬汀和阿魏酸和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷相對(duì)較多；刺紅珠藥材中的刺五加苷E、去甲異紫堇定和巴馬汀較多，而阿魏酸和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷較少；鮮黃小檗藥材中去甲異紫堇定和蟾毒色胺內(nèi)鹽較多。

圖4 小檗皮4種基原差異成分的熱圖分析

4 討論

近年來(lái)，高分辨質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于藥材的分析研究中，UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學(xué)技術(shù)以其高靈敏度、高分辨率、質(zhì)量范圍寬、動(dòng)態(tài)范圍廣[3]等特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確獲得微量化合物的質(zhì)譜信息，快速鑒定化合物結(jié)構(gòu)，尤其適用于對(duì)照品缺乏的化學(xué)成分篩查，在藥材的品種鑒別和質(zhì)量控制等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究從整體代謝物角度出發(fā)，建立了快速鑒定小檗皮藥材化學(xué)成分的方法，較為全面地反映整體代謝成分，結(jié)合模式識(shí)別分析方法篩選出不同基原小檗皮的化學(xué)標(biāo)志物，為小檗皮不同品種鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種可靠準(zhǔn)確的參考方法。盡管基于高分辨質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)已得到快速發(fā)展，但未知代謝成分的鑒定策略仍極具挑戰(zhàn)。藥材中存在許多同分異構(gòu)體的化合物，其二級(jí)碎片離子、裂解規(guī)律都極為相似，若缺乏文獻(xiàn)的核實(shí)以及對(duì)照品的比對(duì)，很難將其進(jìn)行區(qū)分鑒定。在今后的研究中還需進(jìn)一步對(duì)小檗皮中的成分進(jìn)行分離鑒定，不斷健全完善小檗皮的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

本研究采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)小檗皮4種基原藥材的整體化學(xué)成分進(jìn)行快速全面檢測(cè)分析，共鑒定了47種化學(xué)成分，主要包括氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)等初級(jí)代謝產(chǎn)物，以及生物堿等次級(jí)代謝產(chǎn)物。同時(shí)，采用PCA、PLS-DA等模式識(shí)別方法，發(fā)現(xiàn)小檗皮不同基原之間的化學(xué)成分存在一定差異，結(jié)合方差分析，進(jìn)一步篩選出藥根堿、四氫巴馬汀、蟾毒色胺內(nèi)鹽等12個(gè)化學(xué)標(biāo)志物，這些研究結(jié)果對(duì)于小檗皮4種不同基原品種的鑒定、質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)等研究都具有十分重要的意義。

熱圖分析結(jié)果顯示，12個(gè)化學(xué)標(biāo)志物在小檗皮不同基原藥材中分布不均。與鮮黃小檗和刺紅珠比較，匙葉小檗和甘肅小檗藥材中含有更多的藥根堿、四氫巴馬汀等成分?，F(xiàn)代研究表明，藥根堿具有降血糖、調(diào)血脂、抗炎等作用[15-16]，四氫巴馬汀具有明顯的降糖、抗心律失常等生物活性[17]。因此，由于這些有效成分的相對(duì)含量不同，小檗皮不同基原藥材的質(zhì)量很可能存在差異，表明這4個(gè)品種在臨床上作為同一藥材使用可能并不合理，今后應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，為小檗皮不同基原品種的臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Selection of indicative components for identification of different species ofbased on UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS metabolomics

XU Xin-mei1, DU Huan1, YI Huan1, WU Xin-yue1, FENG Tu2, JIANG Gui-hua1, FAN Gang3

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Ecological Engineering, Guizhou University of Engineering Science, Bijie 551700, China 3. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the differences in the overall chemical composition of different species of(,,, and), and to select the chemical markers for species identification.Ultra high performance liquid chromatography-Q-exactive orbitrap-mass spectrometry (UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS) metabolomics was used to analyze the overall chemical composition of different species of, combined with principal component analysis (PCA), partial least square discriminant analysis (PLS-DA) and variance analysis to select chemical markers for identification.A total of 47 chemical components were identified, including 24 alkaloids, 12 organic acids and their derivatives, 5 sugars and their derivatives, and 6 other components. Twelve chemical markers, such as jatrorrhizine, tetrahydropalmatine and bufotenidine, were screened out.UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS metabonomics combined with chemometric methods can effectively clarify the chemical composition differences of different species of, and provide a reference for the identification and the quality control of.

;Schneid.;Maxim.;Schneid.;Franch.; UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS; metabolomics; species identification; indicative components; jatrorrhizine; tetrahydropalmatine; bufotenidine

R286.2

A

0253 - 2670(2022)23 - 7524 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.024

2022-05-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81874370）；四川省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2022YFS0434）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2021]一般090）；貴州省教育廳科技拔尖人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（黔教合KY字[2018] 072）

徐鑫梅，碩士，主要從事中藥品種、品質(zhì)與資源開(kāi)發(fā)研究。Tel: (028)61800160 E-mail: 1483773389@qq.com

通信作者：范 剛，教授，主要從事民族藥質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (028)61800160 E-mail: fangang1111@163.com

馮 圖，教授，主要從事藥用植物學(xué)研究。Tel: (0857)8330068 E-mail: 58689136@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]