HPLC法測(cè)定血平片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量研究

劉厚權(quán)，林飛英，肖忠訓(xùn)，何虎冰，胡吉忠，夏淑英，周朝忠，肖紹川，康興東

（江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安 343100）

血平片由地黃、熟大黃、地榆、三七、海螵蛸、茜草和炒蒲黃等7 味藥材組成，具有清熱化瘀、止血調(diào)經(jīng)的功效，臨床用于治療因血熱挾瘀所致的崩漏[1]。血平片處方中7 味藥材均具有止血的功效，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅采用HPLC 測(cè)定大黃素和大黃酚的含量，顯然不利于保障血平片產(chǎn)品品質(zhì)，尤其是三七作為血平片處方中唯一的貴重藥材，理應(yīng)建立其含量測(cè)定方法。羅漢宇等[2]建立了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1總含量的HPLC 檢測(cè)方法，但其供試品溶液制備方法比較繁瑣，不利于檢驗(yàn)操作?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部[3]中三七藥材是采用HPLC 測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者的總含量；珍黃膠囊[4]、腦脈泰膠囊[5]、活血止痛膠囊[6]、滇女金丸[7]和虎力散片[8]等含有三七的中成藥制劑也均采用HPLC法測(cè)定其中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量，可以較好地保障產(chǎn)品品質(zhì)。故本研究選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1為指標(biāo)成分，采用HPLC 法建立了對(duì)血平片中三七的含量測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)便易行，可以有效控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備

Waters 2695 型高效液相色譜儀（含自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA 檢測(cè)器）；AUW220D 十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本島津公司）；AB104-N 萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；Mili-Q 超純水儀（美國(guó)Milipore 公司）；SHB-IV 循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑與試藥

三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)：110745-201318，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（110703-201128，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.4%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（110704-201223，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.9%）均由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供；乙腈（色譜純）、甲醇（分析純）、正丁醇（分析純）、氨試液（分析純）、乙醇（分析純）、水均來(lái)自自制超純水。血平片共10 批（江西普正制藥有限公司，批號(hào)分別為：171101、171102、171201、171202、180101、180401、180402、180901、180902、181001，規(guī)格：每片重0.3 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫C1（8250 mm 4.6 mm，5m）色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)性B，梯度洗脫（0～20 min，A：20%；20～75 min，A：20%～32%）；流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)200nm，柱溫30℃；進(jìn)樣量10L。

2.2 不含三七的陰性樣品溶液的制備

取大黃150 g，粉碎成粗粉，與450 g地黃混合，加80%乙醇6 倍量，加熱回流提取2 次，每次1 h，合并乙醇提取液，濾過(guò)，濾液備用。藥渣與其他中藥地榆、海螵蛸、茜草和蒲黃（炒）加水煎煮3 次，每次1h，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為的1.10～1.15（60 ℃）清膏，加入乙醇使含醇量達(dá)50%，攪勻，冷藏，取上清液與上述醇提液合并，減壓回收乙醇，并濃縮成相對(duì)密度為1.25～1.30（60 ℃）清膏，80 ℃干燥，粉碎成細(xì)粉，加入淀粉55 g，混勻，制粒，干燥，加入硬脂酸鎂2 g，混勻，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取三七皂苷R1對(duì)照品4.15 mg，人參皂苷Rb1對(duì)照品4.77 mg、人參皂苷Rg1對(duì)照品4.27 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.4 血平片樣品溶液制備方法

取本品20 片，除去薄膜衣，研細(xì)，精密稱定1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，稱重，回流提取2 h，取出，放冷，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25mL，置分液漏斗中，用氨試液25 mL 洗滌1 次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑾♂屩?5mL，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取血平片樣品、陰性樣品，分別按“2.4”項(xiàng)下制備方法制得供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10L 注入液相色譜儀，結(jié)果見(jiàn)圖1；結(jié)果顯示，在供試品溶液色譜圖中，與三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1色譜峰相應(yīng)的位置上有色譜峰，且陰性樣品無(wú)干擾。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）、供試品（B）和陰性對(duì)照品（C）色譜圖Fig.1 The chromatograms of the mix standard (A)、spmples (B) and the negative control (C)

2.6 線性關(guān)系考察

取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rg1對(duì)照品，分別制成不同濃度，取10L注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，三七皂苷R1 在10.38～332.12g/mL范圍內(nèi)，峰面積與對(duì)照品濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程y=2 904 700x 7 487.06，R2=0.999 9；人參皂苷Rg1 在11.93～381.89g/mL 范圍內(nèi)，峰面積與對(duì)照品濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程y=3 190 827x 5 294.24，R2=0.999 8，人參皂苷Rg1在10.69～342.20g/mL 范圍內(nèi)，峰面積與對(duì)照品濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程y=2 946 742x-913.07，R2=0.999 9。

2.7 精密度試驗(yàn)

取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg1混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次吸取10L 注入液相色譜儀，記錄峰面積。求得三七皂苷R1 峰面積的RSD值為3.27%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD值為2.64%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值為4.03%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批血平片樣品1.0 g（181001 批，6份），按供試品溶液制備方法制備，每次吸取10L，注入HPLC 儀器中進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果表明，本品中三七皂苷R1含量平均值為0.23 mg/片，RSD 值為5.04%；人參皂苷Rg1含量平均值為0.75 mg/片，RSD值為1.36%；人參皂苷Rb1含量平均值為1.85 mg/片，RSD 值為0.93%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份血平片供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、12 h、18 h 和24 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，得到三七皂苷R1峰面積的RSD 值為3.24%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD 值為2.62%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD值為4.00%，表明血平片供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取血平片樣品（6 份），分別加入三七皂苷R1對(duì)照品1.22 mg、人參皂苷Rg1對(duì)照品10.29 mg、人參皂苷Rb1對(duì)照品3.53 mg，按“2.4”項(xiàng)下制備方法制得供試品溶液，每次吸取10L，注入HPLC 儀器中進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，三七皂苷R1的平均回收率為97.7%，RSD 值為3.18%；人參皂苷Rg1的平均回收率為98.6%，RSD 值為0.55%；人參皂苷Rg1的平均回收率為100.4%，RSD 值為1.82%。表明該測(cè)定方法偏差較小，回收率良好。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of the recovery test

2.11 樣品含量測(cè)定

取10 批血平片成品按“2.4”項(xiàng)下制備方法制得供試品溶液，每次吸取10L，注入HPLC 儀器中進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2；結(jié)果顯示，10 批血平片的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rg1總含量范圍在1.18～2.15mg/片。

表2 10 批血平片含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The content determination result of 10 batches of Xueping Tablets

3 討論

目前關(guān)于血平片的研究報(bào)道較少，其中在檢測(cè)方法方面僅有羅漢宇等研究建立的方法，但該方法中供試品溶液制備方法比較繁瑣，不利于實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的產(chǎn)品檢測(cè)操作。由于三七既是貴重藥材，又具有良好的止血效果，是血平片處方中非常重要的藥材。因此，有必要對(duì)血平片中的三七實(shí)施質(zhì)量控制。

本試驗(yàn)參考三七藥材及多種含三七的中成藥制劑的檢測(cè)方法，選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg1為檢測(cè)指標(biāo)成分，采用水飽和正丁醇提取、弱堿試液洗滌供試品的處理方法，建立了相對(duì)簡(jiǎn)便的HPLC 含量測(cè)定方法，該方法可以有效控制血平片制劑的質(zhì)量。