何 為 綜述 馬潞林 審校

(北京大學第三醫(yī)院泌尿外科，北京 100191)

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系常見的腫瘤之一，腎臟腫瘤發(fā)病率在全美男性及女性分別排名第7、8位，近5年呈持續(xù)上升趨勢[1]。在我國，RCC同樣呈現(xiàn)明顯增長的趨勢[2]。早期診斷及治療對腫瘤的控制尤為重要，隨著精準醫(yī)學時代的來臨，傳統(tǒng)影像學檢查方法再也無法滿足新的需求，液體活檢的價值逐漸提高，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)檢測技術提供了新的思路。本文對ctDNA在RCC中的應用進行文獻總結。

1 ctDNA的特點

游離DNA (cell-free DNA, cfDNA)是指在幾乎所有的體液(包括血液)中均可檢測到的脫細胞核酸的短片段，參與免疫、凝血、衰老、癌變等各種生理病理現(xiàn)象。在癌癥患者中，一部分血漿中的cfDNA來源于腫瘤，稱為ctDNA，可能與原發(fā)腫瘤具有相同的突變和基因改變。ctDNA的定義為腫瘤細胞釋放到外周循環(huán)系統(tǒng)中攜帶腫瘤信息的DNA片段，是cfDNA的一種特殊類型，主要來源于腫瘤細胞凋亡、壞死、主動釋放、吞噬作用及細胞脫離[3]。

腫瘤患者血液中ctDNA大小受腫瘤細胞釋放方式的影響，一般相比于健康人群的cfDNA更片段化，細胞凋亡釋放的DNA大小為150～180 bp，在壞死過程中，染色質鏈以無序的方式降解，可產(chǎn)生50 kbp的片段[3，4]。腫瘤患者血液中線粒體來源cfDNA(mitochondria-originated cfDNA, mt-cfDNA)片段大小與患者腫瘤負荷及ctDNA濃度呈負相關[5]。另外，ctDNA半衰期較短，一般在100～數(shù)百分鐘，可通過其含量的變化監(jiān)測疾病進展及治療情況[6，7]。

由于ctDNA攜帶特異的腫瘤信息，且半衰期較短，能夠通過其攜帶的信息和含量的變化提供精準的治療方案，并對治療情況進行跟蹤和隨訪，與組織標本相比，ctDNA的優(yōu)點很多：風險小、快速、微創(chuàng)、價格便宜，而且從生物學角度來看，更能代表整個腫瘤，具有廣闊的應用前景。但是ctDNA在外周血液中含量極低，檢測尤其困難，目前檢測方法有：①聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術，包括等位基因特異性PCR(allele specific polymerase chain reaction, AS-PCR)、數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)和數(shù)字PCR結合流式技術(beads, emulsion, amplification, magnetics, BEAM-ing PCR)；②二代測序技術(next generation sequencing, NGS),包括全基因組測序、逆轉錄擴增測序和全外顯子測序；③有針對性的NGS技術，包括基于多重PCR的NGS和基于混合捕獲的NGS；④組合方法[8]。檢測的敏感性取決于所使用的評估技術和遺傳平臺、腫瘤器官、腫瘤分期、腫瘤異質性和克隆性[9]。

2 ctDNA在RCC中的應用

目前，F(xiàn)DA已批準cfDNA應用在非小細胞肺癌和結直腸癌中，分別用于檢測血漿中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的突變情況及SEPTIN9啟動子的甲基化狀態(tài)，并指導靶向藥物的應用，在以EGFR為靶點的藥物治療非小細胞肺癌中，還可以監(jiān)測T790M突變，提示耐藥并更換靶向藥物。在肺癌、卵巢癌、乳腺癌及結直腸癌根治術后，ctDNA的存在被證明與復發(fā)和不良預后相關，甚至通過ctDNA的腫瘤特異性改變預測術后復發(fā)率[10, 11]。唐堂等[12]對46例前列腺癌研究顯示，ctDNA中攜帶HR基因突變的患者在診斷時Gleason評分整體更高(P<0.01)，有更多的轉移灶(P=0.018)，且腫瘤分期更晚(P=0.031)，此外，胚系HR突變較體系HR突變的患者確診年齡更小(P<0.01)。

同樣，在早期和晚期RCC患者血漿中都能檢測到ctDNA，包括在小腫瘤患者的血漿中[13],而且在RCC患者血漿中cfDNA濃度要明顯高于健康人群[14, 15]。在轉移性腎細胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)患者中，ctDNA陽性率為33%，與腫瘤組織NGS檢測結果的一致性達到77%[16]。Zengin等[17]報道839例mRCC中，612例(72.9%)ctDNA基因突變，其中最常見的突變基因為腫瘤蛋白53(tumor protein 53, TP53)(36.9%)、von Hippel-Lindau(VHL)(22.2%)和端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)(7.2%)，腫瘤組織樣本采集時間越近，基因突變與血液ctDNA突變一致性越高。Hahn等[18]比較19例mRCC腫瘤組織和ctDNA的NGS檢測結果，兩者一致率僅為8.6%，腫瘤組織的基因突變比例更高，尤其是在DNA修復基因中，也可能是由于2種方式取樣時間不同所致，提示ctDNA的NGS檢測結果可能更能反映腫瘤基因動態(tài)異質性。2種檢測方法應相互補充，共同評估腫瘤狀態(tài)。

2.1 ctDNA在RCC診斷中的應用

RCC患者血漿中cfDNA水平可作為非侵襲性診斷工具，靈敏度63.0%，特異性78.1%[19]。Hauser等[20]報道30例RCC血漿中cfDNA甲基化水平較健康人群明顯增高(14.3%～54.3% vs.0～16.7%)，并具有高度的特異性(85.2%～100%)，血清中高甲基化的cfDNA檢測可能有助于RCC的診斷，聯(lián)合多個基因的分析可以明顯提高診斷的準確性(60%～74.3%)。Skrypkina等[21]對比27例RCC與15例健康人的血漿樣本，結果顯示血漿中cfDNA水平結合Ras相關區(qū)域家族1A基因(Ras association domain family 1A gene,RASSF1A)、脆性組氨酸三聯(lián)體和腺瘤性結腸息肉病(adenomatosis polyposis coli，APC)基因的CpG島甲基化可以作為癌癥的非侵襲性診斷標志物(AUC=1)[21]。

Zhao等[22]建立小鼠伴有MET突變的乳頭狀腎癌(papillary renal cell carcinoma，pRCC)模型，使用卡博替尼進行治療，檢測ctDNA在疾病進展及治療后的變化，結果顯示ctDNA與模型小鼠的疾病進程的一致性。Pal等[23]對169例pRCC腫瘤組織NGS檢測，證實MET突變在pRCC中的突變率較高，達到33%，及其潛在的治療價值。

2.2 ctDNA判斷RCC患者的預后

液體活檢(包括ctDNA)另一項有前途的應用是確定腎切除術或腎部分切除術后復發(fā)的風險，并在后續(xù)檢查中作為監(jiān)測的生物標志物，以便更早地發(fā)現(xiàn)轉移性疾病。在實性腫瘤中，進展期及轉移性腫瘤患者血液中ctDNA含量高于早期腫瘤患者[24,25]。Wan等[26]在92例RCC的研究中得出類似的結論，其中17例復發(fā)，相比無復發(fā)患者，復發(fā)者術前后血漿cfDNA水平更高(P≤0.024)，且在COX多因素分析中明確cfDNA水平可作為復發(fā)的獨立預測因素(P=0.009)。另一項回顧性研究[27](n=100)對比腫瘤組織中矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2， SHOX2)甲基化水平，結果顯示治療前血漿cfDNA中SHOX2甲基化水平與腎切除術后高死亡風險相關(P<0.001)。一項44例mRCC的研究[28]顯示，18例ctDNA陽性者相較陰性者腫瘤負荷更高(均值8.81 cm vs. 4.49 cm，P=0.04)。

Yamamoto等[29]納入53例腎透明細胞癌，共檢測到16例(30%)38個突變，包括6例TP53突變和5例VHL突變，ctDNA陽性的RCC患者cfDNA片段更小，ctDNA陽性和cfDNA片段化與更差的腫瘤特異性生存率明顯相關(P<0.001，P=0.011)，提示ctDNA陽性和cfDNA片段大小可以作為RCC的預后監(jiān)測指標。Bacon等[16]研究也證實ctDNA陽性患者預后更差，一線治療后無進展生存期(progression-free survival,PFS)更短。

2.3 ctDNA指導個體化用藥

ctDNA水平還可以預測mRCC患者的治療效果。ctDNA水平的動態(tài)變化與mRCC患者接受一線抗程序性死亡受體1(programmed cell death 1, PD1)和抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4, CTLA4)聯(lián)合療法的治療反應相關，ctDNA可作為接受一線免疫檢查點抑制劑治療的mRCC患者治療反應的早期預測因子[30]。Zhang等[31]報道在晚期腫瘤中通過治療前后ctDNA的動態(tài)變化能夠預測是否在免疫治療中獲益，比影像學檢查更早預測疾病進展。Feng等[32]通過實時熒光定量PCR對18例轉移性透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)在索拉非尼治療期間6個不同時間點的cfDNA進行監(jiān)測，治療過程中cfDNA水平越高，藥物反應越差。與疾病進展的患者相比，緩解期或穩(wěn)定期患者在8～24周cfDNA水平較低?？梢?，ctDNA可作為免疫檢查點抑制劑治療反應的預測性生物標志物，具有潛在的價值。

Pal等[33]納入220例mRCC，78.6%的患者檢出ctDNA突變，最常見的變異為TP53(35%)、VHL(23%)、EGFR(17%)、神經(jīng)纖維瘤蛋白1(neurofibromin 1， NF1)(16%)和AT豐富結合域1A(AT-rich interaction domain 1A, ARID1A)(12%)，其中38例和64例分別接受一線藥物治療和二線藥物治療，二線藥物治療患者和一線藥物治療患者基因突變頻率差異最大的分別是TP53 (49% vs.24%)、VHL (29% vs.18%)、NF1 (20% vs.3%)、EGFR (15% vs.8%)和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α基因(phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA) (17% vs.8%)，ARID1A是相同的(13% vs.11%)，如果將一線和二線治療藥物都限制為血管內皮生長因子抑制劑，基因突變的差異將會更顯著，這些差異提示治療耐藥的潛在機制。

目前，正在進行的TARIBO研究是一項Ⅲ期多中心臨床研究，通過ctDNA分析評判，mRCC患者在使用靶向藥物治療的前提下，實施減瘤手術能否改善患者長期生存及預后的影響，并探索靶向治療的耐藥機制[34]。

3 ctDNA檢測面臨的挑戰(zhàn)

盡管取得許多新進展，但ctDNA的廣泛應用仍面臨一些重要的挑戰(zhàn)：首先，ctDNA本身的特點，包括片段化、濃度低、半衰期短，對臨床應用設置障礙，影響結果的準確性和穩(wěn)定性。其次，衰老細胞的生物學特征也為ctDNA的應用增加限制，衰老過程中非癌性病變中體細胞突變，增加混雜因素，尤其是在非癌組織中發(fā)現(xiàn)與癌組織中非常類似的TP53突變，需要更好地了解健康以及特定生理條件下(例如衰老)外周血中的成分[35]。另外，由于高腫瘤突變負荷與免疫檢查點抑制劑的良好反應相關，腫瘤突變負荷被認為是預測免疫治療療效的重要標志物，ctDNA可以作為腫瘤突變負荷的替代，并預測患者對免疫治療的反應[36]。但免疫系統(tǒng)在腫瘤進展的過程對血液中的成分造成改變，需要開發(fā)工具，以便能夠在檢測樣本中研究微環(huán)境和免疫應答對腫瘤發(fā)生的影響。最后，ctDNA在腫瘤患者血漿中的濃度較低，需要對診斷工具進行進一步的改進，以能夠檢測循環(huán)中的少量腫瘤衍生成分。

目前，對于ctDNA的研究大部分為回顧性研究，缺乏前瞻性研究，ctDNA為生物標記的癌癥檢測和監(jiān)測方法的開發(fā)需要大規(guī)模的臨床研究和充足的證據(jù)，不僅是為檢測方法的效率和檢測手段的可靠性，而且是為其臨床實用性。對于每一種腫瘤靶點，可能需要分析數(shù)百名癌癥患者。為驗證該變異是否為腫瘤組織所特有，還應評估大量健康個體作為對照的cfDNA圖譜，對這2組患者進行持續(xù)的臨床隨訪也是必要的，以區(qū)分假陽性和真陽性信號[37]。

ctDNA檢測技術改變了腫瘤的診斷及治療方案，在個體化精準治療的時代，為臨床工作提供新的決策思路，其應用包括腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與診斷、腫瘤發(fā)展進程的監(jiān)測與隨訪、靶向治療的選擇和免疫治療反應等方面，具有廣泛的前景和應用價值，但因其獨特的生物學特點、檢測方法和技術的限制，仍需進一步的研究和論證。