劉曉飛,仇松寅,梅 琳,劉 晗,吳紹強
(1.三亞中國檢科院生物安全中心,海南三亞 572000;2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100176)
我國以經(jīng)濟發(fā)展為目的的養(yǎng)兔生產(chǎn)始于20 世紀50 年代中后期,伴隨著經(jīng)濟的騰飛,我國兔產(chǎn)業(yè)得到了長足發(fā)展。根據(jù)FAO 統(tǒng)計數(shù)據(jù),我國兔總量占全球總量的比例從1970 年的1/4 發(fā)展到現(xiàn)在的2/3,我國已成為名副其實的世界兔產(chǎn)品生產(chǎn)與出口大國,在世界兔產(chǎn)品貿(mào)易中占有重要地位[1]。進入21 世紀,我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,兔作為重要的實驗動物,在免疫學(xué)、心血管疾病、微生物學(xué)、遺傳學(xué)等諸多科研領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。
2018 年9 月,國務(wù)院印發(fā)《中國(海南)自由貿(mào)易試驗區(qū)總體方案》[2],明確提出“劃定特定區(qū)域,通過指定口岸管轄和加強生物安全管理,建設(shè)全球動植物種質(zhì)資源引進中轉(zhuǎn)基地(簡稱“引進中轉(zhuǎn)基地”),探索建立中轉(zhuǎn)隔離基地(保護區(qū))、檢疫中心、種質(zhì)保存中心、種源交易中心”。在中轉(zhuǎn)基地建設(shè)運行過程中,引進中轉(zhuǎn)優(yōu)質(zhì)種兔將進一步帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)在海南省的發(fā)展,為三亞成為具有世界影響力的全球種質(zhì)資源合作示范區(qū)以及先進生物技術(shù)合作交流平臺助力。然而活兔引進過程中所伴隨的潛在生物安全風(fēng)險不容忽視。
本研究以兔出血癥、野兔熱、兔黏液瘤病和兔球蟲病4 種重要兔疫病為研究對象,根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)動物及動物產(chǎn)品進境風(fēng)險分析框架,基于已有的科學(xué)研究數(shù)據(jù),對引進活兔可能傳帶的4 種疫病風(fēng)險進行了評估并提出相應(yīng)的風(fēng)險管理措施,以期為保障中轉(zhuǎn)基地進境兔的生物安全和我國兔產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展提供參考。
1.1.1 兔出血癥 兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease,RHD),俗稱兔瘟,是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起兔的一種高度接觸性傳染病,以全身器官出血為主要特征[3]。WOAH 將其列為須通報動物疫病,我國將其列為二類動物疫病。RHDV 在環(huán)境中有非常強的穩(wěn)定性。研究[4]表明,RHDV 對酸(pH 3.0)、熱(60 ℃,30 min)、乙醚(20%)和氯化鎂(1 mol/L)均具有較強的抵抗力。
1.1.2 野兔熱 野兔熱(tularaemia)是由土拉熱弗朗西斯菌(Francisella tularensis,俗稱土拉桿菌)引起的一種人獸共患急性傳染病,屬于自然疫源性疫病[5]。WOAH 將其列為須通報動物疫病。土拉熱弗朗西斯菌在低溫條件和水中能長時間存活,對熱、紫外線和化學(xué)藥物敏感,56 ℃作用30 min 或日光直射30 min 即可將其滅活,煮沸立即失活;一般消毒藥物均能很快將其殺滅[6-7]。
1.1.3 兔黏液瘤病 兔黏液瘤?。╩yxomatosis)是由黏液瘤病毒(myxoma virus)引起的一種高度接觸性致死性傳染病[8]。WOAH 將其列為須通報動物疫病。該病毒對干燥有較強的抵抗力,其毒力在干燥的黏液瘤結(jié)節(jié)中可保持3 周;對熱敏感,50 ℃作用30 min 即被滅活;對乙醚敏感,但能抵抗去膽酸鹽,這是黏液瘤病毒區(qū)別于其他痘病毒的獨特性質(zhì)[9-10]。
1.1.4 兔球蟲病 兔球蟲?。╟occidiosis)是小腸或膽管上皮細胞內(nèi)寄生了艾美耳屬或等孢屬球蟲而引發(fā)的一種寄生蟲病,是對家兔危害較嚴重的寄生蟲病之一[11]。我國將其列為三類動物疫病。家兔可感染的球蟲共有17 種,其中艾美耳屬球蟲16 種、等孢屬球蟲1 種[12]。目前公認的兔球蟲有效種有11 個[13],其中腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和斯氏艾美耳球蟲呈高致病性。斯氏艾美耳球蟲寄生在肝臟膽管,黃艾美耳球蟲和梨形艾美耳球蟲寄生在大腸,其他8 種均寄生于家兔小腸[14]。球蟲卵囊對外界的抵抗力很強,在惡劣環(huán)境中也可長期存活[15]。
1.2.1 兔出血癥 經(jīng)典RHDV 于1984 年首次在我國被發(fā)現(xiàn)和報道,1986 年該病毒在歐洲出現(xiàn)后迅速傳播,目前已在全球養(yǎng)兔密集地區(qū)流行[16]。2010 年法國首次發(fā)現(xiàn)RHDV2[17],隨后在西班牙、英國、澳大利亞以及北非和北美等國家和地區(qū)傳播和流行[18-19]。我國于2020 年發(fā)現(xiàn)首例RHDV2 感染病例[20]。目前海南島僅有經(jīng)典RHDV 感染發(fā)病的報道,未見有RHDV2 流行。經(jīng)典RHDV 主要感染成年兔,對6~8 周齡兔感染性較低,對4 周齡以下幼齡兔不具備感染性。RHDV2 宿主譜更廣,可感染各種年齡家兔及歐洲野兔Cape hares 品種,是該屬唯一一個可跨種傳播的病毒[21]。RHD 潛伏期為1~6 d,持續(xù)排毒的病兔是RHD 的主要傳染源,通過與感染兔直接或間接接觸傳播,經(jīng)鼻、結(jié)膜和口腔等途徑感染。RHDV 在環(huán)境中的高穩(wěn)定性為其傳播提供了有利條件。
1.2.2 野兔熱 根據(jù)培養(yǎng)特性、致病性和地理分布,土拉熱弗朗西斯菌分為4 個亞種:A 型亞種(Tularensis,Type A)、B 型亞種(Holarctica,Type B)、中亞亞種(Mediasiatica)和新兇手亞種(Novicida)。其中A 型亞種主要分布于北美洲,對人及大多數(shù)哺乳動物具有強毒性;B 型亞種幾乎遍布整個北半球,對動物高度致病,人類也易感但致死率較低[22];中亞亞種主要分布在中亞沙漠地區(qū),報道病例較少,很少引起人類感染;新兇手亞種毒性較低,對人類基本無致病性。我國流行的菌株為B 型亞種[23-24]。海南島未有野兔熱發(fā)病的報道。嚙齒類哺乳動物和兔形目動物是野兔熱最主要的易感動物[25],也有其他哺乳動物、鳥類、兩棲動物和無脊椎動物被感染的報道。野兔熱潛伏期為15 d[26],主要通過蜱、蠅叮咬或直接接觸感染動物傳播,也可通過食入污染的水或食物傳播。
1.2.3 兔黏液瘤病 兔黏液瘤病首次于1896 年發(fā)現(xiàn)于烏拉圭,目前在大洋洲、美洲、歐洲、北非均有流行,我國尚未見有關(guān)報道。本病有高度的宿主特異性,只有兔類易感,其他動物和人沒有易感性。兔黏液瘤病傳染源為病兔和帶毒兔,病兔可通過眼、鼻分泌物或皮膚滲出液向外排毒。在自然界中兔黏液瘤病主要通過吸血昆蟲,如蚊子、跳蚤、刺蠅等機械傳播[27]。
1.2.4 兔球蟲病 兔球蟲病流行廣泛,呈世界性分布,在我國呈地方性流行[28]。該病一年四季均可發(fā)生,其中陰雨季節(jié)多發(fā)。病兔和帶蟲兔可持續(xù)向外界排出卵囊,經(jīng)口食入被卵囊污染的水或飼料可被感染,任何品種、年齡的兔都易感,其中20~45 日齡幼兔易感性最高,發(fā)病率和致死率都較高[29]。
1.3.1 兔出血癥 經(jīng)典RHDV 感染常為急性發(fā)病,表現(xiàn)神經(jīng)和呼吸癥狀。在流行初期常見無癥狀突然抽搐死亡,死亡率可達80%~90%;5%~10%的病兔表現(xiàn)為亞急性或慢性發(fā)病,以明顯肝損傷和脾大為特征。RHDV2 感染以亞急性和慢性病癥為主,死亡率為50%~80%,慢性發(fā)病以全身性黃疸、體重減輕和嗜睡為特征,病程持續(xù)更久[30]。
1.3.2 野兔熱 一般表現(xiàn)為體溫升高,淋巴結(jié)腫大、化膿。急性病例不表現(xiàn)臨床癥狀呈敗血癥死亡,慢性病例多呈高度消瘦和衰竭狀[31]。
1.3.3 兔黏液瘤病 有黏液瘤型和無黏液瘤型(呼吸型)2 種表現(xiàn)型。嚴重的瞼結(jié)膜炎是兔黏液瘤病最常見的癥狀之一,身體各天然孔周圍及面部皮下水腫,頭部皮下腫脹嚴重時呈現(xiàn)典型的“獅子頭”狀,一般在感染后1~2 周死亡;呼吸型主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀,皮膚結(jié)節(jié)較少且較小[32]。
1.3.4 兔球蟲病 分為肝型、腸型和混合型。肝型以幼齡兔居多,腸型以3~4 月齡兔多見,多數(shù)呈混合感染而引發(fā)混合型。肝型球蟲病主要出現(xiàn)黏膜黃疸、腹瀉和腹圍增大等癥狀,在高溫季節(jié)死亡率較高。腸型球蟲病急性感染時病兔表現(xiàn)側(cè)身倒地、四肢僵直、痙攣、角弓反張、迅速死亡;慢性經(jīng)過時,表現(xiàn)食欲減退、腹部膨脹、腹瀉、排血便?;旌闲颓蛳x病會表現(xiàn)肝型和腸型混合的臨床癥狀,剖檢可見白色結(jié)節(jié)病灶[33]。
1.4.1 兔出血癥 RHDV 具有凝集人“O”型紅細胞的特性,故可用血凝試驗(HA)進行初步診斷,但不可作為確診依據(jù)[34]。ELISA、膠體金試紙條等免疫學(xué)方法可以用于RHDV 檢測。RT-PCR、熒光RT-PCR、RT-LAMP 等分子生物學(xué)方法能夠鑒別經(jīng)典RHDV 和RHDV2 感染[35]。我國已發(fā)布檢測兔出血癥病毒的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準[36]。
1.4.2 野兔熱 病原分離鑒定是確診野兔熱最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的方法,但耗時較長,也易引發(fā)實驗室感染[37]。目前常用的方法有血清凝集試驗和ELISA 等血清學(xué)方法,PCR、實時熒光PCR 等分子生物學(xué)方法[38]。我國已發(fā)布診斷野兔熱的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準[39]。
1.4.3 兔黏液瘤病 通常使用兔腎原代細胞或RK13 進行病毒分離培養(yǎng),采用免疫熒光試驗、中和試驗、瓊脂擴散試驗、PCR 和組織病理學(xué)方法進行病毒鑒定[40]。我國已發(fā)布瓊脂擴散試驗檢測兔黏液瘤病毒的農(nóng)業(yè)標(biāo)準和行業(yè)標(biāo)準[41-42]。
1.4.4 兔球蟲病 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)診斷可采取飽和鹽水漂浮法檢查病兔糞便或者腸道內(nèi)容物中是否有球蟲卵囊;實驗室診斷多采用多重PCR、熒光PCR等分子生物學(xué)技術(shù)或補體結(jié)合試驗、ELISA[43]等血清學(xué)方法。我國已發(fā)布兔球蟲檢測行業(yè)標(biāo)準[44]。
1.5.1 兔出血癥 本病尚無有效的治療方法,只能采取以預(yù)防為主的綜合防控措施,注射疫苗是防控該病最有效的手段。目前已有數(shù)種針對經(jīng)典RHDV 的商品化疫苗,但是經(jīng)典RHDV 疫苗不能有效保護RHDV2 感染。
1.5.2 野兔熱 鏈霉素是治療野兔熱最有效的抗生素,此外慶大霉素、金霉素、土霉素也可用于該病的治療。預(yù)防該病的方法主要是驅(qū)除野生嚙齒動物和吸血昆蟲,嚴格做好防疫和隔離消毒工作。另外,接種土拉桿菌凍干減毒活菌苗也可預(yù)防該病[45]。
1.5.3 兔黏液瘤病 本病尚無有效的治療方法。免疫接種、控制媒介昆蟲、防止與野兔直接或間接接觸、加強疫區(qū)運輸工具的消毒處理可防控本病的發(fā)生。國外一般用黏液瘤病毒減毒活疫苗進行免疫,目前一種新型三價重組減毒黏液瘤病毒載體RHDV 和RHDV2 疫苗已獲準在歐盟使用[46]。
1.5.4 兔球蟲病 本病尚無商品化疫苗。一般采用磺胺喹噁啉、二甲氧嘧啶、地克珠利和復(fù)方新諾明等抗球蟲藥物進行治療,由于兔球蟲非常容易產(chǎn)生耐藥性,因此治療過程中要注意交替使用不同藥物。此外,加強飼養(yǎng)管理,做好兔舍內(nèi)的清掃工作,定期對兔舍和周圍環(huán)境進行消毒,引進兔種時進行嚴格檢驗檢疫并隔離,定期取兔糞進行鏡檢,發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊立即采取隔離治療或淘汰[47]等措施,也可有效防控該病發(fā)生。
RHDV 和RHDV2 在世界范圍內(nèi)廣泛分布,近年來RHDV2 在歐洲、非洲、北美以及澳大利亞均有流行。病兔可通過糞便、尿液、鼻液、淚液、皮膚及生殖道分泌物向外排毒。因此,來自疫區(qū)活兔的帶毒風(fēng)險為“高”。
野兔熱的傳染源為帶菌兔。根據(jù)亞種的分布,來自北美洲的活兔攜帶A 型亞種的可能性高,來自北半球的兔均有攜帶B 型亞種的可能。因此,來自疫區(qū)活兔的帶毒風(fēng)險為“高”。
兔黏液瘤病主要流行于大洋洲、美洲和歐洲諸國,我國尚無兔黏液瘤病的公開報道。該病的傳染源為病兔和帶毒兔。病兔可通過眼、鼻分泌物,皮膚滲出液或生殖道分泌物向外排毒,臨診癥狀不典型的病兔或者健康攜帶者也可向外排毒。因此,來自疫區(qū)活兔的帶毒風(fēng)險為“高”。
兔球蟲病在世界范圍內(nèi)廣泛分布。病兔以及健康攜帶者均可持續(xù)向外界排出卵囊。因此,來自疫區(qū)活兔的攜帶球蟲風(fēng)險為“高”。
綜上所述,4 種疫病均可由活兔攜帶,因此進境活兔傳帶4 種疫病的風(fēng)險均為“高”。
RHD 可經(jīng)消化道和呼吸道傳播,接觸糞便等排泄物或污染的飼料、飲水、設(shè)備等均可被感染,經(jīng)典RHDV 主要感染成年兔,RHDV2 可感染不同年齡和品種的兔;野兔熱主要通過蚊、蜱、蠅的叮咬或直接接觸感染動物而傳播,也可能通過食入污染的水或食物傳播,野兔熱是人獸共患病,人類也可能通過直接接觸患病動物而被感染;兔黏液瘤病主要通過吸血節(jié)肢動物的口器而機械傳播;健康兔可通過與感染兔球蟲病兔直接或間接接觸而被傳染,同時也可通過被污染的飼料、飲水、灰塵、用具、兔毛、環(huán)境及飼養(yǎng)管理人員和獸醫(yī)工作人員的手、衣服和鞋子等而被感染。
若進境兔為種兔,在引進中轉(zhuǎn)基地隔離后將進入市場流通環(huán)節(jié),進入全國各地養(yǎng)殖場所,用于后續(xù)的配種和繁育,與易感動物接觸的可能性很高。因此,判定暴露風(fēng)險為“高”。
若進境兔為實驗用兔,進境后將在相對封閉的環(huán)境下飼養(yǎng),用于科學(xué)實驗或教學(xué)等,與原有的實驗兔直接接觸風(fēng)險高,與外界的易感動物直接接觸可能性小,但不排除在節(jié)肢動物活動的季節(jié),由節(jié)肢動物將野兔熱、兔黏液瘤病等傳播給外界易感動物的可能性。因此,判定暴露風(fēng)險為“高”。
綜上所述,易感動物暴露風(fēng)險為“高”。
RHD 在我國呈地方性流行,被稱為養(yǎng)兔業(yè)頭號殺手,兩種病毒型均可引發(fā)較高的發(fā)病率和致死率,且RHDV2 感染的控制難度和危害高于經(jīng)典RHDV 感染。我國于2020 年首次發(fā)現(xiàn)RHDV2,因其與經(jīng)典RDHV 交叉免疫性較弱,現(xiàn)有疫苗不能提供完全免疫保護,一旦發(fā)病將迅速在群體內(nèi)傳播,且無有效的治療手段,感染后的清除難度大。
兔黏液瘤病在我國目前尚未被發(fā)現(xiàn),試驗證明兔黏液瘤病毒對我國家兔的感染率和致死率均為100%。如果傳入,造成的危害和經(jīng)濟損失將無法估量,且兔黏液瘤病以機械性傳播為主,一旦傳入,將難以根除。
我國歷次暴發(fā)的野兔熱均由B 型亞種引起。一旦致病性強的A 型亞種傳入我國并流行,除了引發(fā)兔養(yǎng)殖業(yè)的嚴重經(jīng)濟損失外,作為人獸共患病,還可能會導(dǎo)致人類感染甚至死亡。
兔球蟲病在我國呈地方性流行,是養(yǎng)兔業(yè)長期面臨的難題之一。幼兔的球蟲感染率為90%,死亡率為60%。兔感染球蟲后通常表現(xiàn)亞臨床癥狀,即兔表觀正常,但飼料轉(zhuǎn)化率下降,生長受阻,影響各項生理指標(biāo)。在我國現(xiàn)行的國家標(biāo)準中,球蟲被列為實驗兔應(yīng)排除(除普通級外)的寄生蟲之一[48]。球蟲病傳入中轉(zhuǎn)基地后將持續(xù)產(chǎn)生負面影響。
上述4 種疫病隨進境兔種質(zhì)資源進入中轉(zhuǎn)基地并暴露后將產(chǎn)生一系列的負面影響,短期內(nèi)會造成大量易感動物感染淘汰,長期可能嚴重影響相關(guān)科研進展和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)生產(chǎn),在造成大量經(jīng)濟損失的同時,對三亞打造全球種質(zhì)資源引進中轉(zhuǎn)保藏交易平臺也具有極大的負面影響。與此同時,上述疫病的傳入將對以海南兔(lepus hainanus)為代表的珍稀瀕危野生動物帶來毀滅性打擊,威脅我國的生態(tài)安全。
因此,4 種疫病傳入我國的后果評估風(fēng)險為“極高”。
綜合分析認為,在不采取任何風(fēng)險管理措施的情況下,兔出血癥、兔黏液瘤病、野兔熱和兔球蟲病4 種疫病隨活兔傳入的風(fēng)險為“高”,暴露評估結(jié)果為“高”,依據(jù)綜合評價矩陣,4 種疫病傳入并暴露的風(fēng)險為“高”,結(jié)合后果評估,進境活兔傳帶4 種疫病的風(fēng)險為“極高”。
根據(jù)上述風(fēng)險評估結(jié)果,需根據(jù)實際引種需求和全球動植物種質(zhì)資源引進中轉(zhuǎn)基地保障能力制定適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險管理措施,以控制活兔帶毒為關(guān)鍵控制點,將4 種疫病隨兔種質(zhì)資源引進而傳入的風(fēng)險降至可接受水平。
3.1.1 建設(shè)高水平隔離檢疫設(shè)施 建設(shè)符合種兔隔離檢疫生物安全要求的高水平設(shè)施;選址遠離東方大田、白沙邦溪、陵水南灣等自然保護區(qū);隔離檢疫設(shè)施與外界設(shè)置合理的生物安全屏障;配套相應(yīng)的無害化處理設(shè)施。
3.1.2 提升檢疫實驗室技術(shù)保障能力 針對兔出血癥、兔黏液瘤病、野兔熱和兔球蟲病的檢測診斷技術(shù)需求,在實驗室現(xiàn)有的技術(shù)基礎(chǔ)上開展能力建設(shè),通過CNAS 等認證認可,獲得相應(yīng)的實驗室等級資質(zhì);開展相關(guān)項目的實驗室能力驗證;提升技術(shù)人員業(yè)務(wù)水平,持續(xù)保障種質(zhì)資源的引進中轉(zhuǎn)生物安全。
3.2.1 提升動物疫情風(fēng)險預(yù)警能力 研究建立適合中轉(zhuǎn)基地的全球動物疫病疫情風(fēng)險預(yù)警系統(tǒng),針對兔出血癥、野兔熱、兔黏液瘤病和兔球蟲病進行全數(shù)據(jù)采集和分析,及時發(fā)布疫情風(fēng)險預(yù)警信息。
3.2.2 提升風(fēng)險評估與風(fēng)險管理能力 建設(shè)中轉(zhuǎn)基地動物檢疫風(fēng)險分析專家隊伍,針對中轉(zhuǎn)基地及引種需求,科學(xué)靈活對特定輸出國、疫病流行情況、種質(zhì)資源類型、國內(nèi)應(yīng)用場景開展針對性風(fēng)險評估。根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果,提出針對性境外檢疫技術(shù)要求和管理要求,同時根據(jù)中轉(zhuǎn)基地可接受風(fēng)險水平制定境內(nèi)檢疫監(jiān)管技術(shù)要求(包括抽樣策略、試劑敏感性和特異性等檢測要求及隔離飼養(yǎng)要求等)。
3.2.3 制定新型檢疫監(jiān)管制度 根據(jù)全球動植物種質(zhì)資源引進中轉(zhuǎn)基地的特殊情況,在海南自由貿(mào)易港“一線放開,二線管住”的制度框架下,制定科學(xué)高效的進境活兔隔離檢疫管理制度。對于遺傳背景清晰、來源明確、入境后在僅在島內(nèi)使用的科研用兔,在開展針對性風(fēng)險評估后可適當(dāng)放寬檢疫要求,在指定場所邊隔離邊科研,在確保生物安全的同時保障科研進度和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
3.2.4 提升風(fēng)險監(jiān)測和信息追溯能力 種質(zhì)資源引進后,在繁育和使用過程中進行持續(xù)性抗原抗體檢測,構(gòu)建生物安全信息全鏈條追溯系統(tǒng)。制定科學(xué)的應(yīng)急預(yù)案,一旦發(fā)現(xiàn)風(fēng)險及時采取相應(yīng)的措施,保障風(fēng)險不外泄。
3.2.5 充分開展風(fēng)險交流 在引種前組織境外農(nóng)場、進出口商、引種企業(yè)、境外監(jiān)管部門、國內(nèi)監(jiān)管部門、研究機構(gòu)等利益相關(guān)方充分開展風(fēng)險交流,就引種可能帶來的風(fēng)險交換意見,提升風(fēng)險管理措施的一致性和科學(xué)性。