滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物感染貝氏柯克斯體的調(diào)查

洪汝丹,劉思彤,賀琪楠,羅云燕,朱俊潔,艾志瓊,尹家祥

Q熱是一種由貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii, 簡稱Cb)所引起的人獸共患病，在世界范圍內(nèi)廣為流行。Q熱所引起的持續(xù)性慢性感染尤為嚴(yán)重，其中心內(nèi)膜炎、血管持續(xù)感染和Q熱疲勞綜合征等感染癥狀備受關(guān)注[1]。反芻動物牛羊被認(rèn)為是感染人類Q熱的主要來源[2]。嚙齒動物是Cb重要的儲存宿主[3]。有研究顯示Cb在嚙齒動物中的陽性率與反芻動物的Cb感染率存在一定相關(guān)性[4-5]。目前，已在35種不同的嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)了Cb感染的證據(jù)，分屬26個不同的種屬[6]。有研究認(rèn)為，在疫源地受到Cb感染的嚙齒動物會通過遷徙行為聚集在農(nóng)場附近，因?yàn)檗r(nóng)作物會作為它們度過秋冬季的食物來源，而此時(shí)正是反芻動物繁殖的時(shí)期，Cb在孕獸體內(nèi)的感染機(jī)制會進(jìn)一步被激活，從而認(rèn)為嚙齒動物是Cb感染反芻動物的真正來源[7]。此外，物種特異性生態(tài)群落結(jié)構(gòu)和棲息地環(huán)境需求可以決定宿主和病媒接觸的概率，即使同一屬的物種之間Q熱感染狀況也會有所差異[8]。

滇西鼠疫疫源地鼠形動物種類豐富，物種復(fù)雜多樣，適于各類人獸共患病宿主動物、媒介昆蟲的生存繁殖和病原體的維持傳播，疫源地還存在著家鼠和野鼠不同類型的鼠疫疫源地，在進(jìn)化中形成特有的生物群落結(jié)構(gòu)[9]。在這種特殊的生物地理群落中鼠形動物Q熱的流行分布如何未見報(bào)道，為此，本研究通過滇西鼠疫疫源地中捕獲的野外鼠形動物采用巢式PCR對鼠形動物肝/脾臟組織DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，再對擴(kuò)增的陽性DNA片段測序和序列分析，旨在調(diào)查此地區(qū)野外鼠形動物Cb的感染情況，加強(qiáng)滇西鼠疫疫源地Q熱的防控，對降低Q熱等人獸共患病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2015年12月至2016年10月，以野鼠鼠疫疫源地云南省玉龍縣和劍川縣，家鼠鼠疫疫源地云南省梁河縣為采樣點(diǎn)，玉龍鼠疫疫源地以文筆山及周圍地區(qū)，劍川鼠疫疫源地以石龍、東山地區(qū)，梁河鼠疫疫源地以芒東、河西、囊宋等地區(qū)為采樣調(diào)查區(qū)域。在不同季節(jié)(春、夏、秋、冬)、不同海拔梯度(玉龍鼠疫疫源地以海拔2 800 m劃分；劍川鼠疫疫源地以海拔2 450 m劃分；梁河鼠疫疫源地以海拔1 000 m～、1 200 m～及海拔1 400～1 910 m劃分)、不同生境(耕地、林地、灌叢、耕地林地/耕地灌叢交界)，使用夾夜法進(jìn)行野外捕鼠，以花生為誘餌，沿一定地勢放置鼠夾，傍晚放置，晨起收集捕獲的鼠形動物。

1.2 樣本處理及鼠種鑒定 捕獲的鼠形動物帶回實(shí)驗(yàn)室后根據(jù)其外形進(jìn)行分類鑒定。用75%酒精擦拭鼠形動物的體表，于生物安全柜內(nèi)無菌解剖，取肝臟和脾臟存于-40 ℃?zhèn)溆?。共獲取2 524份肝脾樣本，對采集的肝脾樣本進(jìn)行DNA提取時(shí)，優(yōu)先使用脾臟，若脾臟因在捕獲鼠形動物過程中受損，則選擇肝臟進(jìn)行DNA提取。

1.3 DNA提取和巢式PCR擴(kuò)增 用無菌眼科剪將野外鼠形動物的肝/脾樣本取5～10 mg組織，使用磁珠法微量細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒及全自動核酸自動提取儀(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行DNA提取。

采用巢氏PCR來擴(kuò)增目的CbCom1基因片段。通過兩輪擴(kuò)增，外引物為Com1 F1和Com1 R1，內(nèi)引物為Com1 F2和Com1 R2(見表1)[10]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所提供的Cb國際標(biāo)準(zhǔn)菌株序列RSA493為陽性對照物，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和表3。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，電泳條件為電壓120 V、電流80 mA，電泳30 min，加樣量3 μL/孔。使用Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(美國Thermo Fisher Scientific 公司)和DNA MarkerI(北京 Biomed 公司)，三通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)進(jìn)行PCR檢測。PCR產(chǎn)物的測序送上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 Cb Com1基因巢氏PCR引物Tab.1 Nested PCR primers for Cb Com1

表2 Cb Com1基因巢氏PCR反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of nested PCR for Cb Com1

1.4 測序與統(tǒng)計(jì)分析 登錄(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，將測序成功的陽性序列進(jìn)行BLAST比對，運(yùn)用軟件Megalign和MEGA7.0分析Cb的

表3 Cb Com1巢氏PCR反應(yīng)條件Tab.3 Reaction conditions of nested PCR for Cb Com1

同源性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探索其進(jìn)化來源。應(yīng)用Excel 2010和SPSS20.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析不同疫源地鼠種、性別、生境、海拔梯度、季節(jié)等因素Cb在野外鼠形動物的流行分布情況(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物Cb感染情況 共檢測2 524份DNA樣本，Cb陽性樣本23份，陽性率為0.91%。有2目4科7屬8種野外鼠形動物檢測出Cb陽性，分別是齊氏姬鼠0.64%(5/780)、中華姬鼠2.19%(6/274)、黃胸鼠0.54%(1/184)、社鼠3.64%(2/55)、錫金小鼠1.37%(1/73)、大絨鼠1.03%(5/485)、臭鼩鼱4.08%(2/49)、毛猬1.96%(1/51)，見表4。

表4 滇西鼠疫疫源地不同種類野外鼠形動物Cb感染情況Tab.4 Cb infection in wild small mammals of different species in the natural plague foci of western Yunnan

2.2 不同疫源地、海拔梯度、生境、季節(jié)及性別間Cb感染情況 玉龍鼠疫疫源地野外鼠形動物Cb陽性率為0.34%，劍川鼠疫疫源地為1.46%，梁河鼠疫疫源地為0.80%，3個疫源地野外鼠形動物Cb陽性率不同(χ2=6.575，P=0.037)，劍川鼠疫疫源地Cb陽性率高于玉龍鼠疫疫源地(P<0.017)，其余疫源地兩兩比較無差異。玉龍鼠疫疫源地海拔2 800 m以下和2 800 m以上野外鼠形動物Cb陽性率分別為0.51%和0.30%(P>0.05)。劍川鼠疫疫源地海拔2 450 m以下和2 450 m以上野外鼠形動物Cb陽性率分別為0.13%和4.64%，海拔梯度2 450 m以上Cb陽性率高于2 450 m以下(χ2=28.504，P<0.001)。梁河鼠疫疫源地海拔1 000～1 200 m、1 200～1 400 m和1 400～1 910 m野外鼠形動物Cb陽性率分別為0.56%、0.48%和1.27%(P>0.05)。不同生境野外鼠形動物的Cb陽性率耕地、林地、灌叢、耕地林地/耕地灌叢交界分別為1.09%、0.61%、0%和1.94%，不同生境Cb感染無差異(P=0.071)。野外鼠形動物Cb陽性率春季為2.44%，夏季0.55%，秋季0.37%，冬季0.62%，不同季節(jié)Cb陽性率不同(χ2=17.730，P=0.001)，春季高于秋季(P<0.008)，其余季節(jié)兩兩比較無差異。Cb陽性率雄性為0.96%，雌性為0.86%，性別間Cb感染差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.076，P=0.782)。(見表5)。

表5 不同影響因素野外鼠形動物Cb感染情況Tab.5 Cb infection in wild small mammals of different influencing factors

2.3 CbCom1基因同源性分析 滇西鼠疫疫源地樣本內(nèi)部的同源性為98.9%～100%。選取部分有代表性的參考序列與滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物樣本測序序列一同構(gòu)建同源性分析圖，結(jié)果顯示本次調(diào)查所得到的基因序列與來自伊朗單峰駱駝(MH373681)、韓國長角血蜱類(AY342038)、美國安氏革蜱(Z11828)、保加利亞歐柳鶯(MH703039)、俄羅斯全溝硬蜱(MH703042)、中國云南YS-8菌株(AF318148)和中俄邊境黑瞎子島嚙齒動物(JX522479)的Cb序列同源性都在99.0%以上。與美國海獅的胎盤中檢出的Cb序列GU797241的同源性為96.3%～96.8%，與澳大利亞淡水小龍蝦螯蝦立克次體序列EF413062的同源性為90.7%～91.2%(見圖1)。

圖1 Cb Com1基因片段同源性分析Fig.1 Homology analysis of the Com1 gene fragment of Cb

2.4 CbCom1基因系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)BLAST匹配對比分析，23份陽性樣本Com1基因序列和GenBank收錄的部分參考序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示所有樣本和參考序列都隸屬于一個大分支，和中俄邊境黑瞎子島嚙齒動物(JX522479)、意大利囊形扇頭蜱類(KT071010)、中國云南YS-8菌株(AF318148)、俄羅斯全溝硬蜱(MH703042)、澳大利亞條紋袋鼠(HM804027)、澳大利亞淡水小龍蝦螯蝦(EF413062)、保加利亞歐柳鶯(MH703039)、印度荷斯坦牛黑白花奶牛(MK902739)、印度牛(MK902734)、美國安氏革蜱(Z11828)、韓國長角血蜱類(AY342038)、伊朗單峰駱駝(MH373681、MH373682)構(gòu)成一個小分支。雖然美國海獅的胎盤中檢出的序列GU797241和HM237793與以上參考序列和樣本呈現(xiàn)出一定的差異性，但仍隸屬于相同小分支。另一小分支為伊朗鴿銳緣蜱檢出的類柯克斯體內(nèi)共生體MF359024，與上述分支里的意大利囊形扇頭蜱類(KT071010)和韓國長角血蜱類(AY342038)相比，提示類柯克斯體內(nèi)共生體在不同地區(qū)不同蜱種之間存在一定的差異性；與外群俄羅斯Cb菌種質(zhì)粒QpDV的開放閱讀框架(ORF)的片段序列X84772為不同分支(見圖2)。

注：■玉龍鼠疫疫源地樣本 ▲劍川鼠疫疫源地樣本 ●梁河鼠疫疫源地樣本圖2 基于Cb Com1基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the Com1 gene fragment of Cb

3 討 論

Q熱在世界范圍內(nèi)是一種廣為流傳的人獸共患病，且宿主動物眾多。至今發(fā)現(xiàn)野生動物能自然感染Q熱者已達(dá)90種以上，其中以嚙齒類動物最多[11]。國內(nèi)報(bào)道，在眾多嚙齒動物中，喜馬拉雅旱獺、達(dá)烏利亞黃鼠、褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠、黑線姬鼠、大林姬鼠、灰倉鼠、社鼠等被檢測出Cb感染；國外報(bào)道感染Cb的嚙齒動物多達(dá)26屬35種，遍布亞洲、非洲、歐洲和北美洲[12]。在本次滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物Cb感染的調(diào)查中，齊氏姬鼠、中華姬鼠、錫金小鼠、大絨鼠、臭鼩鼱、毛猬為首次檢測出Q熱病原體Cb，尤其是食蟲目中的臭鼩鼱和毛猬，提示存在Cb感染的鼠形動物并不僅僅局限于嚙齒目動物。在世界各國對嚙齒動物Cb感染情況的調(diào)查分析中，褐家鼠的Cb陽性率最高[13]，但在本次實(shí)驗(yàn)中并未在褐家鼠中檢出陽性，這可能與被檢測的褐家鼠樣本較少有關(guān)。

滇西鼠疫疫源地不同生境(耕地、林地、灌叢、耕地林地/耕地灌叢交界)野外鼠形動物Cb感染除灌叢外，其余3種生境里都檢出了野外鼠形動物存在Cb感染。有血清學(xué)實(shí)驗(yàn)研究指出野生嚙齒動物的Q熱感染情況和綿羊的Cb感染率相關(guān)，與家畜(牛羊等動物)共享?xiàng)h(huán)境的野生嚙齒動物有更高的Cb陽性率；但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)沒有與家畜接觸的生境中，嚙齒動物也存在Cb感染的情況(如生活在灌木叢內(nèi))，但陽性率極低，說明嚙齒動物在疫源地對維持Q熱在自然界的循環(huán)起到一定作用[12]。有研究顯示野外鼠形動物的Cb帶菌狀態(tài)和它們所在的生存環(huán)境存在一定的關(guān)聯(lián)[14]。但針對野外鼠形動物不同生境Cb感染狀況的研究極少，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也缺乏相關(guān)系統(tǒng)的研究報(bào)道做一些對比分析。劍川鼠疫疫源地的Cb陽性率高于玉龍鼠疫疫源地，玉龍和劍川鼠疫疫源地同屬于野鼠鼠疫疫源地，在地理環(huán)境特征，生態(tài)群落結(jié)構(gòu)方面都極其類似，但在野外鼠形動物Q熱流行分布上卻不同，這可能與兩大疫源地之間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在一定的差異有關(guān)。滇西鼠疫疫源地春季野外鼠形動物Cb陽性率高于秋季。在以人為基礎(chǔ)的Q熱研究中，春季是Q熱的高發(fā)季節(jié)，其中的高危因素是與反芻動物接觸，從而導(dǎo)致Cb感染率的季節(jié)性上升，這一結(jié)論與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致[15]，滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物春季Cb感染情況是否與反芻動物的接觸有關(guān)，這一點(diǎn)還缺乏更為系統(tǒng)的調(diào)查。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)滇西鼠疫疫源地宿主動物寄生蚤的季節(jié)消長規(guī)律與此次野外鼠形動物Cb感染情況存在一定的聯(lián)系，滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物的Cb感染情況可能與一些節(jié)肢動物的生活史規(guī)律、季節(jié)消長規(guī)律、宿主寄生嗜性和宿主生活狀態(tài)有一定關(guān)聯(lián)[16]。蜱通常被認(rèn)為是Cb感染反芻動物和野生動物的傳播媒介，也是維持其傳播的載體，甚至可以直接將Cb傳播給人類，有研究顯示，野生鼠形動物→蜱→家畜的關(guān)系鏈存在于不同的地理環(huán)境中，使得Q熱在不同宿主動物中的流行分布更加開放多元化[17]。因此，監(jiān)測宿主動物和節(jié)肢動物之間的季節(jié)消長情況有利于探索動物群落的動態(tài)變化與Q熱流行分布的內(nèi)在結(jié)構(gòu)規(guī)律。不同海拔梯度野外鼠形動物Cb感染情況，劍川疫源地的高海拔地區(qū)野外鼠形動物有較高的陽性率，這與章域震等[18]研究所得出的Q熱流行分布在云南省南部和西部相對低海拔地區(qū)和江河峽谷地區(qū)的結(jié)論有所不同，在云南以往的研究中，針對Q熱的研究對象，主要是一些大型的反芻動物如牛羊等，且采樣地多聚集在低海拔地區(qū)，因此系統(tǒng)地調(diào)查Q熱在不同宿主動物不同海拔梯度中的流行分布情況，將會使Q熱疫情動態(tài)監(jiān)控更加全面具體。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果23份Cb陽性樣本Com1基因測定序列同源性分析顯示，除美國海獅的胎盤中檢出的Cb序列GU797241和澳大利亞淡水小龍蝦螯蝦立克次體序列EF413062外，其余參考序列與滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物樣本的同源性為98.9%～100%，說明在世界范圍內(nèi)CbCom1基因片段高度保守。進(jìn)化分析顯示所測序列與云南YS-8菌株序列[19]同屬一支，其同源性分析達(dá)100%，提示滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物存在的Cb感染狀況對人類存在一定的致病風(fēng)險(xiǎn)，但CbCom1基因因其進(jìn)化的高度保守性，還需一些更為系統(tǒng)的研究來闡述這個問題。

本研究通過Com1基因擴(kuò)增檢測滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物的Cb陽性情況，該基因?qū)儆趩慰截惢?，其序列高度保守，是分子系統(tǒng)學(xué)中的一種極有價(jià)值的分子標(biāo)記，在構(gòu)建生命樹的主干及主干和末梢之間的分枝中具有重要的作用。相對于多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)分析[20]、單核苷酸多態(tài)性分型[21]等高精度分型方法來說，使用單拷貝基因Com1檢測Cb相對單一。目前宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)在Cb感染檢測中逐漸興起，有研究通過mNGS對珠海市某醫(yī)院不明原因急性發(fā)熱患者的血漿樣本進(jìn)行檢測，驗(yàn)證了mNGS是一種可靠、有效的實(shí)驗(yàn)室診斷Q熱的方法[22]。Jiao Jun等[23]使用mNGS對云南微小裂頭蚤的DNA樣本進(jìn)行快速評估，再使用PCR結(jié)合DNA測序分析來鑒定Cb在云南微小裂頭蚤中的感染。Cb分子檢測方法多樣，但也存在著方法造價(jià)昂貴，能否快速簡便檢測等的問題。而Cb菌株分子特征對于比較不同動物物種的基因型、追蹤疾病暴發(fā)和評估毒株基因型與毒力之間的關(guān)系至關(guān)重要，因此，尋求精確快速簡單經(jīng)濟(jì)的Cb分型檢測方法也是未來需要繼續(xù)深入研究的問題。

綜上，滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物Cb陽性率較低，但野外鼠形動物Cb感染廣泛，其中齊氏姬鼠、中華姬鼠、錫金小鼠、大絨鼠、臭鼩鼱、毛猬為首次檢測出Q熱病原體Cb。CbCom1基因片段在野外鼠形動物中呈現(xiàn)出高度保守的流行與分布。鼠疫疫源地野外鼠形動物Cb感染的調(diào)查，對有效防控人群的Q熱感染有重要意義。

利益沖突：無

引用本文格式：洪汝丹,劉思彤,賀琪楠,等. 滇西鼠疫疫源地野外鼠形動物感染貝氏柯克斯體的調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：1031-1038. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.146