調(diào)控工程在光合藍(lán)細(xì)菌中的應(yīng)用

董正鑫，孫韜，陳磊，張衛(wèi)文

（1天津大學(xué)化工學(xué)院合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2天津大學(xué)生物安全戰(zhàn)略研究中心，天津 300072；3教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；4教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津 300072；5化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

化石燃料仍是當(dāng)前人類社會(huì)生活依賴的主要能源，每年由化石燃料所產(chǎn)生的CO2超過300億噸［1］，CO2的過度排放加劇了溫室效應(yīng)，造成全球氣候變化，甚至威脅人類生存環(huán)境。此外，化石燃料為不可再生資源，其大規(guī)模消耗帶來潛在的能源危機(jī)，據(jù)估算全球化石燃料可能在50～100年后耗盡［2］。在能源與環(huán)境問題雙重壓力的背景下，開發(fā)清潔能源、改變能源結(jié)構(gòu)迫在眉睫。我國政府于2020年第七十五屆聯(lián)合國大會(huì)提出，CO2排放量在2030年前達(dá)到峰值，爭(zhēng)取在2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和。在隨后的2021年國務(wù)院政府工作報(bào)告，以及中央財(cái)經(jīng)委員會(huì)第九次會(huì)議中均制定了相關(guān)政策。要實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”和“碳中和”的目標(biāo)，將大氣中的CO2重新轉(zhuǎn)化為燃料或化學(xué)品從而實(shí)現(xiàn)CO2資源化利用，無疑是一舉兩得的策略。2018年，中國科學(xué)院液態(tài)陽光課題組施春風(fēng)教授等［2］提出利用太陽能、CO2和水生產(chǎn)綠色燃料的“液態(tài)陽光”策略，以太陽能為驅(qū)動(dòng)實(shí)現(xiàn)CO2資源化利用，更為理想地解決能源問題與CO2排放問題。在較低營養(yǎng)條件下，光合藍(lán)細(xì)菌能夠在太陽能驅(qū)動(dòng)下，以CO2和H2O為原料合成有機(jī)物。隨著合成生物學(xué)發(fā)展，已實(shí)現(xiàn)利用光合藍(lán)細(xì)菌作為生物底盤進(jìn)行近百種燃料和化學(xué)品的綠色生物合成，也被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)“液態(tài)陽光”的技術(shù)方案之一［3］。因此，基于光合藍(lán)細(xì)菌發(fā)展“液態(tài)陽光”技術(shù)，實(shí)現(xiàn)CO2的資源化利用，有助于解決能源問題與環(huán)境問題，助力“碳達(dá)峰”和“碳中和”的實(shí)現(xiàn)。

近年來，隨著科研人員的努力，以光合藍(lán)細(xì)菌為生物底盤已實(shí)現(xiàn)了近百種生物燃料和化學(xué)品的合成［4-6］。例如，在集胞藻PCC 6803中正丁醇在28 d產(chǎn)量達(dá)到4.8 g/L［7］，在聚球藻PCC 7002中烷烴產(chǎn)量達(dá)到了7.5 mg/g［8］，在聚球藻UTEX 2973中3-羥基丙酸產(chǎn)量達(dá)到68.29 mg/L［9］，聚羥基丁酸酯在集胞藻PCC 6803中能夠占細(xì)胞干重的81%［10］。這些生物燃料與化學(xué)品在光合藍(lán)細(xì)菌中成功生產(chǎn)，表明光合藍(lán)細(xì)菌作為“細(xì)胞工廠”進(jìn)行高附加值化學(xué)品生產(chǎn)具有可行性，且在生物塑料生產(chǎn)方面具有天然優(yōu)勢(shì)。

盡管以光合藍(lán)細(xì)菌為底盤進(jìn)行了近百種化學(xué)品的生產(chǎn)，但其工業(yè)化程度較低。其主要原因?yàn)楣夂纤{(lán)細(xì)菌生長速度慢、生物量低和魯棒性差等。例如，集胞藻PCC 6803的倍增時(shí)間為4.3 h［11］，聚球藻PCC 7942的倍增時(shí)間為4.9 h［12］，而大腸桿菌的倍增時(shí)間為20 min［13］，釀酒酵母的倍增時(shí)間大約為90 min［14］。工業(yè)化過程中光合藍(lán)細(xì)菌在大規(guī)模培養(yǎng)過程中要面臨環(huán)境變化引起的高光、高溫、低溫、高鹽以及高堿等非生物脅迫［15-16］，限制其生長及最終生物量，同時(shí)在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，丁醇［17］、3-羥基丙酸［18］、乙醇［18］等產(chǎn)品的積累也會(huì)抑制其生長。光合藍(lán)細(xì)菌基因操作后不能脫除抗性標(biāo)簽，限制了光合藍(lán)細(xì)菌基因改造的程度，難以實(shí)現(xiàn)菌株生產(chǎn)、生長以及耐受的同時(shí)優(yōu)化。因此，為了對(duì)光合藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠進(jìn)行更深層次優(yōu)化，尋找新的解決方案勢(shì)在必行。

調(diào)控工程（regulatory engineering）基于天然調(diào)控系統(tǒng)，通過對(duì)天然調(diào)控系統(tǒng)元件進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)調(diào)控系統(tǒng)的信號(hào)感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)控因子作用過程的干預(yù)，完成對(duì)多基因表達(dá)水平的調(diào)控，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)全局代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。在大腸桿菌生產(chǎn)靛藍(lán)的研究中，Chen等［19］采取共培養(yǎng)的生產(chǎn)方式，將靛藍(lán)合成前體物質(zhì)色氨酸的生產(chǎn)優(yōu)化與靛藍(lán)合成途徑優(yōu)化分別在兩個(gè)菌株中進(jìn)行，其中色氨酸生產(chǎn)途徑優(yōu)化包含5個(gè)基因的過表達(dá)，靛藍(lán)合成途徑包含1個(gè)基因的過表達(dá)，最終產(chǎn)量達(dá)到55.4 mg/L。由此可見，微生物中高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)往往需要對(duì)整體代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重新調(diào)整，這一復(fù)雜過程的實(shí)現(xiàn)需要同時(shí)對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，而通過對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行逐一調(diào)控費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率不高，為平衡菌株生長與產(chǎn)品產(chǎn)量需將前提供應(yīng)與生產(chǎn)在兩株菌中進(jìn)行。在上述研究基礎(chǔ)上，Chen等［19］對(duì)靛藍(lán)生產(chǎn)菌株中編碼RNA聚合酶的α亞基的基因rpoA進(jìn)行隨機(jī)突變、篩選，靛藍(lán)產(chǎn)量達(dá)到了80.6 mg/L。此外，基于調(diào)控工程實(shí)現(xiàn)菌株對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行自適應(yīng)調(diào)控是實(shí)現(xiàn)智能化細(xì)胞工廠的關(guān)鍵，Jia等［20］在大腸桿菌中使用RNA溫度響應(yīng)開關(guān)與群感系統(tǒng)結(jié)合組成的基因線路，控制不同溫度下表達(dá)不同的熱耐受基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的梯度耐熱。Bao等［21］用群感系統(tǒng)控制調(diào)控RNA，將生長過程與生產(chǎn)過程分離，低密度菌體時(shí)不對(duì)生產(chǎn)途徑的競(jìng)爭(zhēng)途徑進(jìn)行抑制，保證底盤的快速生長，當(dāng)菌體密度達(dá)到閾值后，群感系統(tǒng)控制調(diào)控RNA開始表達(dá)，對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)途徑進(jìn)行抑制，在大腸桿菌生產(chǎn)松萜的應(yīng)用中，松萜產(chǎn)量提高了365.3%。在異養(yǎng)微生物中對(duì)調(diào)控系統(tǒng)的研究充分說明了調(diào)控工程的應(yīng)用潛力，在光合藍(lán)細(xì)菌中有望通過調(diào)控工程取得更大研究進(jìn)展。

目前，在藍(lán)細(xì)菌中基于合成生物學(xué)方法進(jìn)行化學(xué)品生產(chǎn)以及底盤魯棒性提高的相關(guān)報(bào)道已有許多［5，17，22］，在取得進(jìn)展的同時(shí)也面臨著很多挑戰(zhàn)。以光合藍(lán)細(xì)菌中異丁醇生產(chǎn)為例。在聚球藻PCC 7942中，Li等［23］將糖原合成關(guān)鍵基因glgC進(jìn)行敲除后，使更多碳源流向異丁醇合成途徑，在50 mmol/L NaHCO3的條件下異丁醇產(chǎn)量達(dá)到了550 mg/L。為進(jìn)一步提高聚球藻PCC7942中異丁醇的產(chǎn)量，Wu等［24］在2% NaCl培養(yǎng)條件下培養(yǎng)工程菌株，在鹽脅迫條件下促進(jìn)了工程菌株脂質(zhì)降解，增加了異丁醇合成所需的NADH，并增加了膜通透性，有助于異丁醇排出，降低異丁醇毒性，最終異丁醇產(chǎn)量達(dá)到637 mg/L。在加鹽培養(yǎng)環(huán)境下，光合藍(lán)細(xì)菌底盤整體代謝模式和膜特性的改變有益于異丁醇的生產(chǎn)，表明了光合藍(lán)細(xì)菌在全局水平調(diào)控有進(jìn)一步提高異丁醇產(chǎn)量的優(yōu)化空間。值得注意的是，加鹽培養(yǎng)條件盡管提高了異丁醇產(chǎn)量，但同時(shí)抑制了菌株生長，異丁醇產(chǎn)量的提高，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。從全局代謝調(diào)控的水平上對(duì)響應(yīng)鹽信號(hào)后對(duì)異丁醇生產(chǎn)有益的模塊給予一個(gè)模擬鹽信號(hào)刺激，而不利于生長以及生產(chǎn)的鹽響應(yīng)模塊不能接受該模擬信號(hào)，同時(shí)加強(qiáng)異丁醇耐受調(diào)控模塊，提高底盤對(duì)異丁醇的耐受性，從而進(jìn)一步提高異丁醇產(chǎn)量是一個(gè)較為理想的狀態(tài)。因此，發(fā)展調(diào)控工程實(shí)現(xiàn)對(duì)全局代謝網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)調(diào)控對(duì)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠的發(fā)展很有必要。

為了應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，細(xì)胞會(huì)通過整體代謝網(wǎng)絡(luò)的改變來實(shí)現(xiàn)對(duì)于代謝的精準(zhǔn)調(diào)控。細(xì)胞接收刺激信號(hào)后會(huì)通過胞內(nèi)的調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行一系列復(fù)雜過程對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行差異性表達(dá)，如圖1所示。細(xì)胞對(duì)環(huán)境適應(yīng)過程往往是多基因差異性表達(dá)的結(jié)果。例如，在單一鹽脅迫條件下，集胞藻PCC 6803約有100個(gè)基因參與到這一調(diào)控過程［25］。鑒于調(diào)控系統(tǒng)的精準(zhǔn)性和廣泛性，調(diào)控工程有望實(shí)現(xiàn)基因的多層次調(diào)控以及代謝流重新分配，進(jìn)一步提高藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)能力。近年來，圍繞光合藍(lán)細(xì)菌調(diào)控工程在非生物脅迫以及代謝調(diào)控方面的研究取得諸多進(jìn)展。為此，本文對(duì)藍(lán)細(xì)菌中調(diào)控工程應(yīng)用與前景進(jìn)行闡述，對(duì)藍(lán)細(xì)菌底盤構(gòu)建的挑戰(zhàn)進(jìn)行了總結(jié)和分析，以期促進(jìn)魯棒性藍(lán)細(xì)菌底盤的構(gòu)建及其未來的規(guī)?；瘧?yīng)用。

圖1 藍(lán)細(xì)菌調(diào)控系統(tǒng)Fig.1 Cyanobacterial regulatory systems

1 藍(lán)細(xì)菌中代表性的調(diào)控系統(tǒng)

藍(lán)細(xì)菌在自然界中分布廣泛，包括海洋、陸地和河流等，能夠適應(yīng)不同的環(huán)境以維持生存［26］。為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，處于不同環(huán)境下的藍(lán)細(xì)菌必須能夠接收外界環(huán)境條件變化的信號(hào)，并通過調(diào)控系統(tǒng)完成靶基因差異性表達(dá)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝模式的精準(zhǔn)改變。藍(lán)細(xì)菌中能夠在不同環(huán)境下實(shí)現(xiàn)全局代謝模式精準(zhǔn)改變的調(diào)控系統(tǒng)引起了人們的廣泛興趣。目前，藍(lán)細(xì)菌中廣泛研究的調(diào)控系統(tǒng)主要包括雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component systems，TCS）、σ因子和sRNA調(diào)控系統(tǒng)，在適應(yīng)環(huán)境脅迫過程中扮演重要角色［27-29］。

1.1 TCS在環(huán)境適應(yīng)中的作用

雙組分調(diào)控系統(tǒng)在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、噬菌體、酵母、植物以及低等動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，但在細(xì)菌中最為常見，尤其是在革蘭氏陰性菌中［30］。經(jīng)典的TCS主要包括負(fù)責(zé)感知并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的組氨酸激酶（histidine kinases，Hik）與接收信號(hào)并改變胞內(nèi)生理機(jī)能的響應(yīng)調(diào)控蛋白（response regulators，Rre）兩部分。TCS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如圖2所示，Hik接受環(huán)境刺激后，以三磷酸腺苷（ATP）為底物，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到組氨酸殘基，進(jìn)行自磷酸化，形成高能量磷酸基團(tuán)，隨后磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Rre的天冬氨酸殘基。Rre構(gòu)型發(fā)生改變后，結(jié)合到調(diào)控基因的啟動(dòng)子區(qū)域，完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控基因差異表達(dá)［31］。目前，在多種微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TCS以及不同TCS的響應(yīng)條件，例如酵母熱休克響應(yīng)機(jī)制［32］、大腸桿菌酸適應(yīng)機(jī)制［33］、谷氨酸棒狀桿菌缺氧調(diào)節(jié)機(jī)制［34］等。

圖2 TCS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程Fig.2 TCS signal transduction process

光 合 藍(lán) 細(xì) 菌 中TCS的 研 究 在Kaneko等［35］1996年完成集胞藻PCC 6803的全基因組測(cè)序后，得以快速發(fā)展。在聚球藻PCC 6301中鑒定出37個(gè)與TCS相關(guān)的基因，而這株菌與模式菌株聚球藻PCC 7942基因組非常相似［36］?；蚪M分析后預(yù)測(cè)，在集胞藻PCC 6803中至少有90個(gè)基因與TCS有關(guān)［37］，但目前大部分TCS基因的調(diào)控功能尚不明確。集胞藻PCC 6803全基因組測(cè)序的完成和TCS相關(guān)基因的預(yù)測(cè)讓TCS突變體庫的構(gòu)建成為可能。作者課題組通過在集胞藻PCC 6803中構(gòu)建了44個(gè)Rre缺失突變庫，鑒定出與丁醇耐受相關(guān)的響應(yīng)調(diào)控蛋白Slr1037［38］和與酸耐受相關(guān)的響應(yīng)調(diào)控蛋白Slr1909［39］，并對(duì)Rre缺失突變的中心碳代謝以及能量代謝進(jìn)行分析［40-41］。隨著藍(lán)細(xì)菌中TCS研究工作的開展，其調(diào)控機(jī)制與靶基因被解析清楚［27］，揭示了TCS在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要地位，為在藍(lán)細(xì)菌中使用TCS工程，實(shí)現(xiàn)精確的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控提供了理論支持和參考依據(jù)。

1.2 σ因子的分類及其調(diào)控過程

σ因子是原核生物體內(nèi)一類調(diào)控蛋白，參與RNA聚合酶（RNAP）全酶的形成［42］。σ因子調(diào)控過程如圖3所示，RNAP核心酶復(fù)合體與σ因子結(jié)合后形成全酶，在σ因子的引導(dǎo)下，RNAP錨定到特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)特定基因表達(dá)的σ因子并非是特定的，取決于啟動(dòng)該基因表達(dá)的環(huán)境信號(hào)。在不同環(huán)境下，激活不同的基因表達(dá)模式，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，以應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。

RNAP的核心酶由6個(gè)單獨(dú)的亞基構(gòu)成［43］，如圖3所示。RNAP的核心酶與σ因子結(jié)合形成RNAP，進(jìn)而具備激活靶基因轉(zhuǎn)錄的功能。大腸桿菌中σ因子主要分為RpoD（σ70）與RpoN（σ54），而藍(lán)細(xì)菌中沒有發(fā)現(xiàn)與RpoN（σ54）具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白［44］，僅存在RpoD（σ70）家族的σ因子。依據(jù)結(jié)構(gòu)差異σ70家族主要分為4個(gè)亞家族。第1組σ因子稱為初級(jí)σ因子，分為4個(gè)結(jié)構(gòu)部分：σ1、σ2、σ3、σ4，在細(xì)菌中廣泛存在，負(fù)責(zé)組成型基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因在細(xì)胞生長過程中具有重要作用［45］。第2～4組σ因子稱為選擇性σ因子，具有特定的功能。初始狀態(tài)抗σ因子與選擇性σ因子結(jié)合，抑制選擇性σ因子發(fā)揮作用，在接收到環(huán)境變化信號(hào)后，選擇性σ因子被釋放，與RNAP結(jié)合激活靶基因轉(zhuǎn)錄［46］。這類σ因子如同分子開關(guān)，能夠引導(dǎo)RNAP開啟或關(guān)閉一類基因的轉(zhuǎn)錄。第2組σ因子與第1組σ因子在結(jié)構(gòu)上相差最小，僅缺少σ1.1區(qū)域，大部分的選擇性σ因子屬于第2組，能夠與第1組σ因子競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控某些基因的表達(dá)［47］。第3組σ因子主要調(diào)控初級(jí)σ因子不參與調(diào)控的基因，在結(jié)構(gòu)上與第1組σ因子相比缺少了σ1區(qū)域。第4組σ因子稱為胞質(zhì)外作用σ因子，負(fù)責(zé)感應(yīng)胞質(zhì)外環(huán)境變化，能與第1組σ因子在調(diào)控基因上產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，在結(jié)構(gòu)上與第1組σ因子相比缺少了σ1與σ3區(qū)域［48］。

圖3 σ因子調(diào)控過程Fig.3 Sigma factor regulation process

σ因子作為一種脅迫響應(yīng)元件，在面臨環(huán)境脅迫時(shí)，能夠調(diào)控代謝途徑，以應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。因此，在以光合藍(lán)細(xì)菌為底盤進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)的調(diào)控中，使用σ因子工程調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄具有可行性。目前，多種σ因子在藍(lán)細(xì)菌中的調(diào)控作用已被報(bào)道，例如SigB能夠響應(yīng)熱刺激、鹽脅迫以及溫度等環(huán)境變化［49-50］，SigC與熱適應(yīng)相關(guān)［51］，SigD與SigE能夠響應(yīng)光誘導(dǎo)［50］，SigF與鹽脅迫適應(yīng)以及分泌系統(tǒng)相關(guān)，缺失SigF的菌株在鹽脅迫條件下出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷［52-53］。在聚球藻PCC 7942中，4個(gè)σ因 子（RpoD2、RpoD6、RpoD5和SigF2）在RpaA的調(diào)控下調(diào)控生物鐘［54］，σ因子SinA與聚球藻的熱適應(yīng)相關(guān)［55］。隨著藍(lán)細(xì)菌中σ因子研究的進(jìn)行，其調(diào)控過程和靶基因相繼得到解析，有助于對(duì)藍(lán)細(xì)菌σ因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，為藍(lán)細(xì)菌中σ因子調(diào)控工程提供參考。

1.3 sRNA的分類及其調(diào)控過程

生物體內(nèi)除常見的mRNA、tRNA、rRNA外還存在具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在原核生物體內(nèi)這些具有調(diào)控功能的非編碼RNA長度通常為50～500個(gè)核苷酸［29］，一般將長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA稱為長鏈非編碼RNA［56］，這些具有調(diào)控功能的調(diào)控RNA統(tǒng)稱為sRNA。其調(diào)控過程如圖4所示。sRNA通常不具有開放讀碼框，不編碼蛋白質(zhì)，部分sRNA可直接與DNA結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過程，大多數(shù)情況下通過完全或不完全的堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)mRNA，具有抑制翻譯過程或維持mRNA穩(wěn)定的作用，參與到基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段［57］。sRNA參與調(diào)節(jié)的另一種形式是與蛋白結(jié)合改變蛋白結(jié)構(gòu)從而調(diào)控蛋白的催化活性［58］。sRNA在藍(lán)細(xì)菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)非常重要的地位，在集胞藻PCC 6803中，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，推測(cè)sRNA調(diào)控了集胞藻PCC 6803中10%的基因［59］。sRNA參與光合藍(lán)細(xì)菌在多種環(huán)境下的響應(yīng)調(diào)控，例如CoaR參與丁醇脅迫條件下的調(diào)控［60］，RblR參與光合作用過程調(diào)控［61］，Nc117參與短鏈醇耐受調(diào)控過程［62］等。

圖4 sRNA調(diào)控過程Fig.4 sRNA-mediated regulatory process

在集胞藻PCC 6803、聚球藻PCC 7942和聚球藻UTEX 2973中，通過比較分析發(fā)現(xiàn)諸多潛在調(diào)控RNA位點(diǎn)［63-64］，為后續(xù)sRNA的研究提供了研究方向。sRNA參與了藍(lán)細(xì)菌在多種環(huán)境下調(diào)控過程，在鹽、堿、熱、低營養(yǎng)等環(huán)境刺激下，轉(zhuǎn)錄組具有明顯差異，其中的潛在sRNA也發(fā)現(xiàn)具有明顯不同［65-66］，揭示了sRNA在藍(lán)細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化中具有重要作用。sRNA在不同環(huán)境條件下的表達(dá)模式也受到整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，在同一環(huán)境條件下，存在多種調(diào)控方式的共同作用，通過其他形式調(diào)控sRNA的表達(dá)量來進(jìn)一步調(diào)控效應(yīng)蛋白的表達(dá)［67］。

2 藍(lán)細(xì)菌的調(diào)控工程

以藍(lán)細(xì)菌為底盤進(jìn)行各種化學(xué)品的生產(chǎn)近年來已取得較大進(jìn)展，但藍(lán)細(xì)菌的大規(guī)模培養(yǎng)以及產(chǎn)率問題嚴(yán)重制約著工業(yè)化進(jìn)程。為進(jìn)一步提高藍(lán)細(xì)菌底盤的魯棒性以及產(chǎn)品產(chǎn)率，一方面要尋找性能更為優(yōu)異的藍(lán)細(xì)菌底盤［68-69］，而另一方面要對(duì)藍(lán)細(xì)菌代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化。局部代謝調(diào)控在藍(lán)細(xì)菌代謝工程中已取得顯著成果，為進(jìn)一步提高藍(lán)細(xì)菌底盤魯棒性優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，以藍(lán)細(xì)菌調(diào)控系統(tǒng)為著手點(diǎn)，進(jìn)行藍(lán)細(xì)菌全局范圍內(nèi)的代謝調(diào)控是進(jìn)一步提高藍(lán)細(xì)菌耐受性以及產(chǎn)品產(chǎn)率的重要方法［70-73］。

2.1 TCS工程在藍(lán)細(xì)菌中的研究與應(yīng)用

TCS作為細(xì)胞內(nèi)具有感知外部環(huán)境變化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的系統(tǒng)，調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)以適應(yīng)環(huán)境變化方面的重要性毋庸置疑。目前，在藍(lán)細(xì)菌中已對(duì)多種TCS在不同環(huán)境下的功能進(jìn)行了鑒定，其中部分TCS已作為工程方法在藍(lán)細(xì)菌中進(jìn)行了應(yīng)用。

2.1.1 TCS工程在金屬離子調(diào)控中的作用

藍(lán)細(xì)菌正常生理活動(dòng)需要一定量金屬離子的參與，但過量的金屬離子會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。例如，銅離子具有維持細(xì)胞色素氧化酶和質(zhì)體藍(lán)素的正常功能的作用，在集胞藻PCC 6803中，Hik31-Rre34具有監(jiān)測(cè)胞內(nèi)銅離子濃度、調(diào)控銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。Hik31能夠特異性響應(yīng)銅離子并與銅離子結(jié)合，監(jiān)測(cè)胞內(nèi)銅離子濃度，胞內(nèi)銅離子濃度升高后，Hik31將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至Rre34，Rre34結(jié)合到銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白copBAC的啟動(dòng)子區(qū)域，提高CopBAC的表達(dá)量，進(jìn)而降低胞內(nèi)銅離子濃度［74］。copM與Hik31-Rre34在同一操縱子，具有結(jié)合一價(jià)銅離子與二價(jià)銅離子的能力，在Rre34缺失突變體內(nèi)過表達(dá)CopM能夠緩解銅離子敏感表型同時(shí)胞內(nèi)銅離子濃度恢復(fù)到正常水平［75］，而Rre34能夠結(jié)合CopM-Hik31-Rre34操縱子啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控該操縱子的表達(dá)［74］。

因工業(yè)生產(chǎn)過程中鎘的使用，鎘離子在環(huán)境中廣泛存在，且比銅離子毒性更強(qiáng)。Sll0649是集胞藻PCC 6803中的一個(gè)響應(yīng)調(diào)控蛋白，參與鎘離子耐受調(diào)控過程，同時(shí)與胞內(nèi)Cu2+、Cd2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等多種二價(jià)金屬離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)，能夠結(jié)合到sll1598和slr0798（分別編碼Mn2+和Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的上游區(qū)域，敲除sll0649基因后，菌株會(huì)對(duì)上述金屬離子更加敏感［76］。因此，Sll0649在維持集胞藻PCC 6803胞內(nèi)二價(jià)金屬離子穩(wěn)態(tài)方面扮演重要角色，為TCS工程調(diào)控藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)二價(jià)金屬離子穩(wěn)態(tài)提供了方向。

2.1.2 TCS工程在抗紫外輻射調(diào)節(jié)中的作用

太陽光中的紫外光（UV），尤其是其中的UV-B輻射（280～320 nm），對(duì)藍(lán)細(xì)菌的生存提出挑戰(zhàn)。類菌胞素氨基酸（MAA）具有吸收UV-B輻射、保護(hù)細(xì)胞的作用［77］，在藍(lán)細(xì)菌受到UV-B輻射時(shí)能夠在胞內(nèi)積累且有助于細(xì)胞脫水后恢復(fù)。在Nostoc flagelliformeCCNUN1中，對(duì)參與到紫外輻射信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的LuxR家族的Rre OrrA進(jìn)行過表達(dá)后，提高了MAA合成相關(guān)基因的表達(dá)量，菌株的UVB輻射耐受性與脫水后恢復(fù)能力增加［78］。該研究在Nostoc flagelliformeCCNUN1中鑒定出了由mysC1、mysC2、mysA、mysB和mysD組成的MAA生物合成基因簇，并證明MAA的生物合成響應(yīng)UV-B輻射，且響應(yīng)過程受到Rre OrrA調(diào)控，進(jìn)一步確定了Rre OrrA能夠作用到MAA合成基因的啟動(dòng)子位置。MAAs類物質(zhì)在提高藍(lán)細(xì)菌抗干旱以及耐輻射能力方面具有極大潛力，同時(shí)可以作為具有高附加值的防曬霜有效成分進(jìn)行生產(chǎn)［79］。

2.1.3 TCS工程調(diào)控藍(lán)細(xì)菌丁醇耐受

TCS工程能夠提高藍(lán)細(xì)菌底盤對(duì)毒性產(chǎn)品的耐受性。在藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行丁醇生產(chǎn)的過程中，丁醇作為產(chǎn)物對(duì)藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)具有毒性，限制藍(lán)細(xì)菌的生長，進(jìn)一步限制了其產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，如何提高藍(lán)細(xì)菌對(duì)丁醇的耐受性成為提高丁醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。

在集胞藻PCC 6803中通過對(duì)Rre缺失突變庫進(jìn)行篩選，篩選出Slr1037與Sll0039缺失突變體對(duì)丁醇更為敏感［38，80］。在集胞藻PCC 6803中，對(duì)編碼響應(yīng)調(diào)控蛋白的slr1037和sll0039基因分別進(jìn)行過表達(dá)，突變菌株對(duì)丁醇耐受性均有所提高，當(dāng)這兩個(gè)基因同時(shí)過表達(dá)時(shí)，丁醇耐受性較野生型提高133%［37］。值得注意的是，在集胞藻PCC 6803中丁醇耐受性不僅受到Rre Slr1037與Sll0039的調(diào)控，還受到sRNA CoaR的調(diào)控［60］，其中CoaR對(duì)丁醇耐受有負(fù)調(diào)控效果，在slr1037的缺失突變體中抑制CoaR的產(chǎn)生能夠恢復(fù)丁醇耐受性，通過蛋白組學(xué)比較發(fā)現(xiàn)Rre Slr1037與sRNA CoaR存在潛在的共同調(diào)控靶點(diǎn)［67］。由此可見，藍(lán)細(xì)菌對(duì)丁醇耐受性的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜過程，包含了至少兩種調(diào)控方式，且兩種調(diào)控過程存在串?dāng)_。

2.1.4 TCS工程調(diào)控藍(lán)細(xì)菌鹽耐受以及碳代謝

鹽脅迫的改善對(duì)藍(lán)細(xì)菌使用海水進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖具有非常重要的意義［22］，同時(shí)鹽脅迫條件下的代謝模式有利于一些產(chǎn)品例如蔗糖、甘油葡萄糖苷（GG）的生產(chǎn)［24］，而鹽脅迫下調(diào)控系統(tǒng)及其代謝模式的研究有助于調(diào)控工程在藍(lán)細(xì)菌中的使用。在集胞藻PCC 6803鹽脅迫條件下TCS的研究中，通過對(duì)Hik缺失突變體庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了Hik33、Hik34、Hik16和Hik41能夠感知鹽脅迫環(huán)境，控制了集胞藻PCC 6803中20%與鹽誘導(dǎo)基因的表達(dá)，其中Hik33感知鈉離子而Hik16與Hik41僅感知NaCl［81］。Hik34在感知鹽脅迫條件后能夠?qū)⑿盘?hào)傳遞給Rre1，進(jìn)一步調(diào)控乙醇脫氫酶AdhA的表達(dá)［82］。此外通過對(duì)潛在絲氨酸/蘇氨酸激酶突變體庫篩選后，發(fā)現(xiàn)SpkG也具有感知鹽脅迫的功能［83］。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下Hik2與Hik34共同調(diào)控Rre1［84］，而Hik2感受器受Na+的嚴(yán)格誘導(dǎo)［85］。鹽脅迫條件下細(xì)胞容易發(fā)生聚團(tuán)現(xiàn)象，形成生物膜抵抗外界環(huán)境影響，在集胞藻PCC 6803中Hik36-Hik43和Rre6組成的雙組分系統(tǒng)能夠感知外部環(huán)境變化后提高胞外多糖以及抑制與菌毛形成相關(guān)蛋白PilT2的合成，促進(jìn)生物膜的形成［86］。

在聚球藻PCC 7942中Synpcc7942_1125與Synpcc7942_1404基因缺失突變體能夠增加鹽耐受性，增加菌株內(nèi)糖原的積累量，降低光損傷。有趣的是，Synpcc7942_1125與Synpcc7942_1404不調(diào)控蔗糖（可作為滲透保護(hù)劑）合成基因的表達(dá)，且雙突變體不能進(jìn)一步增加單突變體的效果［87］。在魚腥藻PCC 7120中，Rre OrrA能接收鹽脅迫信號(hào)，促進(jìn)蔗糖的積累以維持滲透壓的平衡，過表達(dá)Rre OrrA后提高了蔗糖的積累量［88］。同時(shí)，OrrA促進(jìn)σ因子SigB2的產(chǎn)生，而SigB2進(jìn)而促進(jìn)蔗糖的積累。SigB2缺失突變體在鹽脅迫初期，蔗糖積累延遲，證明其在鹽脅迫響應(yīng)初期具有重要作用［88］。由此可見，在不同脅迫時(shí)間段，應(yīng)采用不同的調(diào)控策略以保證菌株的生存。此外，OrrA在干旱條件下同樣具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)的作用［89］，表明其具有增加底盤多元抗逆的潛力。

目前，通過TCS工程方法，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化產(chǎn)品產(chǎn)量已在藍(lán)細(xì)菌中進(jìn)行了初步應(yīng)用。在集胞藻PCC 6803中，Rre37參與氮缺乏條件下的代謝調(diào)控，單獨(dú)過表達(dá)Rre37能夠改變參與三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)［90］。最近報(bào)道，將Rre37與SigE在集胞藻PCC 6803中同時(shí)進(jìn)行過表達(dá)能夠提高琥珀酸產(chǎn)量，在黑暗厭氧條件下琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到420 mg/L［91］，為琥珀酸生產(chǎn)提供了一個(gè)良好的底盤。

2.2 σ因子工程在藍(lán)細(xì)菌中的研究與應(yīng)用

第1組σ因子與第2組σ因子在結(jié)構(gòu)上非常相似，主要負(fù)責(zé)調(diào)控胞內(nèi)組成型啟動(dòng)子控制的基因的表達(dá)，這些基因通常是細(xì)菌正常代謝所需的。在藍(lán)細(xì)菌中，第2組σ因子往往參與到環(huán)境變化信號(hào)響應(yīng)調(diào)控過程，如營養(yǎng)、光和溫度等［27］。

2.2.1 σ因子工程在藍(lán)細(xì)菌抵抗非生物脅迫中的作用

在集胞藻PCC 6803中，構(gòu)建第2組σ因子的4種三重敲除菌株（ΔsigCDE、ΔsigBDE、ΔsigBCE、ΔsigBCD），在不同光照條件及鹽脅迫條件下進(jìn)行生長表型的測(cè)定，4種突變體在低光條件下生長速度降低，推測(cè)這4種σ因子可能參與了光適應(yīng)調(diào)節(jié)模塊。有趣的是，僅有SigB存在的突變體在鹽耐受表型上較野生菌株有小幅度提高，說明SigB在鹽適應(yīng)過程中具有非常重要的作用［92］。在魚腥藻PCC 7120中存在屬于第2組σ因子的SigB2也能夠響應(yīng)鹽脅迫信號(hào)，并參與滲透相容性溶質(zhì)蔗糖的代謝調(diào)控，促進(jìn)鹽脅迫條件下蔗糖的積累［88］。更為有趣的是，在集胞藻PCC 6803中SigB還具有增加其他脅迫條件下菌株適應(yīng)性的能力，僅過表達(dá)SigB顯著提高了菌株熱耐受與丁醇耐受，將46℃條件下細(xì)胞CFU（colony-forming units）值提高了20倍，在2.5%丁醇中處理1 h的條件下過表達(dá)SigB的突變株存活率提高了15倍［93］。

此外σ因子在藍(lán)細(xì)菌適應(yīng)氧化脅迫條件中均發(fā)揮著重要作用。在集胞藻PCC 6803中，第2組σ因子均參與氧化應(yīng)激過程調(diào)控，其中SigB和SigD起主要作用，而SigC和SigE起次要作用，ΔsigBCE菌株在單線氧、高光誘導(dǎo)氧化脅迫和H2O2氧化脅迫條件下的生長優(yōu)于對(duì)照，而ΔsigCDE菌株在H2O2氧化脅迫條件也較對(duì)照菌株也體現(xiàn)出生長優(yōu)勢(shì)，其主要原因是僅有一個(gè)第2組σ因子存在時(shí)，其表達(dá)量有所提高［51］。

2.2.2 σ因子工程調(diào)控藍(lán)細(xì)菌的中心碳代謝

σ因子作為代謝調(diào)控工具已經(jīng)在藍(lán)細(xì)菌中有了初步應(yīng)用。SigE在集胞藻PCC 6803中參與到碳代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，在對(duì)sigE敲除突變株、sigE過表達(dá)突變株以及野生型進(jìn)行蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SigE具有調(diào)控糖原降解以及與光合作用相關(guān)蛋白豐度的功能［94］。在集胞藻PCC 6803中，SigE與Rre37共同表達(dá)時(shí)能夠提高琥珀酸產(chǎn)量［91］，單獨(dú)過表達(dá)SigE增加了在氮饑餓條件下生物塑料聚羥基丁酸酯的合成［95］。SigE因子在藍(lán)細(xì)菌中普遍存在，但在不同藍(lán)細(xì)菌中扮演的調(diào)控角色有所差異，在魚腥藻PCC 7120中的SigE與異形胞的形成相關(guān)，而在聚球藻PCC 7002中的SigE負(fù)責(zé)調(diào)控某些基因在平臺(tái)期的特定轉(zhuǎn)錄［96-97］。

2.3 sRNA工程在藍(lán)細(xì)菌中的研究與應(yīng)用

非編碼RNA在細(xì)菌體內(nèi)大量存在，其中具有調(diào)控作用的sRNA還未完全解析。sRNA參與了基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及轉(zhuǎn)錄后多個(gè)過程的調(diào)控，對(duì)于胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持作用不言而喻。sRNA與mRNA相互作用的機(jī)制較為簡單，已經(jīng)在藍(lán)細(xì)菌中開發(fā)出對(duì)應(yīng)的調(diào)控工具［98］。

2.3.1 sRNA工程在Fe2+缺乏環(huán)境下的作用

水環(huán)境中鐵離子缺乏往往是限制藍(lán)細(xì)菌的生長條件之一，鐵離子缺乏影響了光合反應(yīng)中Fe2+或Fe/S復(fù)合物依賴性蛋白的活性。在集胞藻PCC 6803中，sRNA IsrR對(duì)在鐵離子缺乏、高光脅迫以及氧化脅迫條件下積累的蛋白質(zhì)IsiA進(jìn)行負(fù)調(diào)控，過表達(dá)sRNA IsrR突變株在H2O2的條件下響應(yīng)時(shí)間延長，而過表達(dá)sRNA IsrR的反義RNA的突變體的響應(yīng)時(shí)間縮短［99-100］，響應(yīng)時(shí)間的減少更有利于菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。

2.3.2 sRNA工程在藍(lán)細(xì)菌光適應(yīng)以及碳固定中的作用

光照條件影響藍(lán)細(xì)菌光合反應(yīng)過程，不同光照條件下參與光合反應(yīng)的酶的表達(dá)量具有差異，這種差異的產(chǎn)生主要由不同光照條件下菌株對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行精確的差異性表達(dá)產(chǎn)生，這個(gè)調(diào)控過程有sRNA的參與。D1蛋白是光合系統(tǒng)Ⅱ的一個(gè)關(guān)鍵亞基，由psbA編碼，調(diào)控psbA的表達(dá)是藍(lán)細(xì)菌響應(yīng)光照條件變化調(diào)節(jié)光合反應(yīng)過程的一種方式。在集胞藻PCC 6803中，存在sRNA PsbA2R和PsbA3R，分別調(diào)控基因psbA2和psbA3的表達(dá)，光照條件下PsbA2R和PsbA3R上調(diào)，促進(jìn)靶標(biāo)基因的表達(dá)，而在黑暗條件下PsbA2R和PsbA3R下調(diào)，降低靶標(biāo)基因的表達(dá)［103］。敲除PsbA2R后，psbA2的表達(dá)量較對(duì)照菌株下降了50%，光合系統(tǒng)Ⅱ的活性下降了15%［103］。

藍(lán)細(xì)菌在自然界中不僅有黑暗和光照條件的變化，還要應(yīng)對(duì)太陽直射產(chǎn)生的高光條件。因此提高藍(lán)細(xì)菌高光耐受也是提高工程藍(lán)細(xì)菌魯棒性的一個(gè)重要方面。sRNA能夠調(diào)節(jié)藍(lán)細(xì)菌在不同光照條件下光合系統(tǒng)蛋白的表達(dá)量，在高光條件下起到光保護(hù)的作用。在集胞藻PCC 6803中，sRNA PsrR1在高光刺激后，能夠在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)，結(jié)合到psaL、psaJ、chlN和cpcAmRNAs的核糖體結(jié)合區(qū)域，抑制mRNA的翻譯，進(jìn)而適應(yīng)高光環(huán)境［104］。

sRNA還能夠調(diào)控光合系統(tǒng)與碳反應(yīng)之間的平衡。RuBisCO是光合生物體內(nèi)非常重要的一種酶，能夠催化CO2固定途徑的第1步反應(yīng)。在集胞藻PCC 6803中，sRNA RblR在高光條件下具有高表達(dá)量，能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合到編碼了RuBisCO大亞基的rbcL基因的mRNA，增加其穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)RbcL的合成［61］，增加CO2固定效率。高光條件下RuBisCO含量增加，促進(jìn)CO2固定消耗光合系統(tǒng)產(chǎn)生的能量以及還原力，對(duì)維持整個(gè)系統(tǒng)的平衡具有重要的意義。

藍(lán)細(xì)菌中同一種sRNA可能參與多種脅迫條件下的調(diào)控。在藍(lán)細(xì)菌中sRNA Yfr1能夠與編碼鈉離子依賴的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白sbtA基因的mRNA結(jié)合，抑制sbtA的翻譯過程，將sRNA Yfr1敲除后，在正常條件下藻藍(lán)蛋白與葉綠素a的含量降低，但能夠正常生長，而在鐵離子缺乏、鹽脅迫、活性氧脅迫以及鈣離子缺乏多種脅迫條件下生長受到抑制［105］。

2.3.3 sRNA工程在化學(xué)品生產(chǎn)優(yōu)化中的作用

藍(lán)細(xì)菌在進(jìn)行化學(xué)品生產(chǎn)過程中，不僅要面臨自然條件下的非生物脅迫，還要面臨生產(chǎn)過程中代謝產(chǎn)物積累所帶來的脅迫。在正丁醇生產(chǎn)過程中，隨正丁醇產(chǎn)量的增加，對(duì)藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，提高底盤正丁醇耐受性是進(jìn)一步提高正丁醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。在集胞藻PCC 6803中，過表達(dá)sRNA CoaR后，sRNA CoaR與輔酶A合 成相關(guān)的基因slr0847和slr0848的mRNA的啟動(dòng)子位置結(jié)合加強(qiáng)，沉默輔酶A合成相關(guān)的基因的表達(dá)，導(dǎo)致輔酶A積累量減少，同時(shí)降低了脂肪酸代謝和能量代謝，使菌株的正丁醇耐受性降低［60］，而敲除sRNAcoaR能夠提高其對(duì)正丁醇耐受性［67］。CoaR對(duì)輔酶A合成量的調(diào)控也證明了其在碳流調(diào)控方面同樣具有潛力。

在集胞藻PCC 6803中，對(duì)sRNA Nc117進(jìn)行過表達(dá)，提高了對(duì)短鏈醇的耐受性，而sRNA Nc117的表達(dá)促進(jìn)了編碼D-甘油-α-D-甘露庚糖1-磷酸鳥苷基轉(zhuǎn)移酶基因slr0007的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)LPS合成途徑，推測(cè)LPS的合成是提高短鏈醇耐受性的原因［62，64］。

（5）加強(qiáng)缺陷處理后的養(yǎng)護(hù)，防止出現(xiàn)二次缺陷，已處理混凝土表面快要出凝時(shí)在表面涂刷一層養(yǎng)護(hù)劑，保證涂刷均勻，不漏刷。

3 挑戰(zhàn)與展望

近年來合成生物學(xué)研究的發(fā)展極大促進(jìn)了光合藍(lán)細(xì)菌的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。值得指出的是，有關(guān)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠構(gòu)建及其挑戰(zhàn)已有很多優(yōu)秀的論文和綜述發(fā)表［106-108］，感興趣的讀者可以進(jìn)行閱讀。本文中，我們將聚焦在藍(lán)細(xì)菌中應(yīng)用調(diào)控工程的挑戰(zhàn)與展望。

雖然不少TCS、σ因子以及sRNA的功能及其調(diào)控響應(yīng)機(jī)制被逐漸定義，但尚不滿足光合藍(lán)細(xì)菌中調(diào)控系統(tǒng)發(fā)展的需要，仍有大量調(diào)控系統(tǒng)元件機(jī)器功能未表征。最新研究表明，在酵母中通過隨機(jī)裝配耐受相關(guān)抗逆基因線路、實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化和多步篩選得到了具有多重耐受性的菌株，實(shí)現(xiàn)智能抗逆菌株的構(gòu)建［109］。而在光合藍(lán)細(xì)菌中仍需研究不同環(huán)境下響應(yīng)模塊開發(fā)新的調(diào)控工具，以促進(jìn)光合藍(lán)細(xì)菌多元抗逆底盤的開發(fā)。以藍(lán)細(xì)菌為生產(chǎn)底盤進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)，往往發(fā)現(xiàn)在某一脅迫環(huán)境下更加有助于化學(xué)品的生物合成，通過調(diào)節(jié)外部脅迫環(huán)境平衡生長與產(chǎn)量之間的關(guān)系可以取得較高產(chǎn)品產(chǎn)率［24，110］，但當(dāng)前調(diào)控工程在光合藍(lán)細(xì)菌中對(duì)多基因精確調(diào)控的研究不足，很難開發(fā)和應(yīng)用這樣的調(diào)控工具。人工sRNA在光合藍(lán)細(xì)菌中已有廣泛應(yīng)用，具有可編程性，極大便利了研究者的使用［111］。因此，為增加調(diào)控工程的靈活性，在光合藍(lán)細(xì)菌中開展對(duì)調(diào)控系統(tǒng)功能蛋白工程改造的研究也是必要的。

3.1 調(diào)控系統(tǒng)功能的闡明

光合藍(lán)細(xì)菌中調(diào)控系統(tǒng)功能未知是影響調(diào)控工程應(yīng)用的主要障礙。對(duì)調(diào)控系統(tǒng)功能的研究主要包括兩個(gè)步驟：①調(diào)控系統(tǒng)元件及功能預(yù)測(cè)；②對(duì)預(yù)測(cè)元件功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

光合藍(lán)細(xì)菌中調(diào)控系統(tǒng)組成部分繁多，逐一鑒定過于煩瑣。借助生物信息學(xué)方法，對(duì)光合藍(lán)細(xì)菌調(diào)控系統(tǒng)及功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，能夠減少實(shí)驗(yàn)量，提高效率。篩選后的調(diào)控系統(tǒng)元件需要進(jìn)行功能驗(yàn)證。在之前研究中，針對(duì)未知功能的調(diào)控系統(tǒng)元件構(gòu)建突變體庫［76，80，112］，使用不同環(huán)境條件進(jìn)行篩選確定不同調(diào)控系統(tǒng)元件的功能，但此方法篩選通量低。因此，如圖5（a）所示，在光合藍(lán)細(xì)菌中基于CRISPR技術(shù)，開發(fā)單堿基編輯和CRISPRi等技術(shù)，在光合藍(lán)細(xì)菌中快速完成建庫工作，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)預(yù)測(cè)調(diào)控系統(tǒng)單元的快速篩選［113-115］。最后，通過對(duì)高通量篩選出的調(diào)控系統(tǒng)單元進(jìn)行調(diào)控途徑研究，解析調(diào)控系統(tǒng)單元在特定調(diào)控過程中的作用。

3.2 調(diào)控工程相關(guān)工具的開發(fā)

基于天然調(diào)控系統(tǒng)元件，設(shè)計(jì)基因線路，實(shí)現(xiàn)不同條件下特定代謝通路的激活［圖5（b）］，進(jìn)一步開發(fā)能響應(yīng)環(huán)境和生理變化對(duì)胞內(nèi)能量、碳流進(jìn)行分配，平衡生長與生產(chǎn)關(guān)系的智能細(xì)胞工廠。

研究得較為廣泛的淡水藍(lán)細(xì)菌的模式菌株集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7942為多拷貝菌株，拷貝數(shù)與菌株生長周期和環(huán)境因素有關(guān)［116-118］，而基因組拷貝數(shù)在菌株基因組改造、純合工程菌株篩選中具有重要意義。在聚球藻PCC 7942中，DnaA在光照條件下與DNA復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)DNA復(fù)制，在黑暗或電子傳遞鏈?zhǔn)艿揭种茣r(shí)，DnaA與DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的結(jié)合受到抑制［119］。因此，有望通過調(diào)控工程改變信號(hào)通路，以達(dá)到能夠控制光合藍(lán)細(xì)菌基因拷貝數(shù)的目的。

此外，基于調(diào)控系統(tǒng)開發(fā)新的技術(shù)方法。sRNA與靶標(biāo)依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行作用，其工作原理較為簡單?；诖耍ㄟ^人工設(shè)計(jì)sRNA靶定到靶基因的mRNA抑制基因的表達(dá)，已在藍(lán)細(xì)菌中進(jìn)行使用［111］。CcaS/CcaR屬于TCS系統(tǒng)，能夠響應(yīng)綠光誘導(dǎo)，表達(dá)控制基因?；贑caS/CcaR工作原理，控制異丁醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)生長與生產(chǎn)過程分離，將異丁醇產(chǎn)量提高到238 mg/L［120］。

因此，基于調(diào)控系統(tǒng)工作原理開發(fā)更多功能模塊實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基因線路是調(diào)控系統(tǒng)研究的一個(gè)重要方向。

3.3 多基因的調(diào)控

光合藍(lán)細(xì)菌中部分調(diào)控系統(tǒng)單元功能已進(jìn)行了驗(yàn)證，見表1。對(duì)同一脅迫環(huán)境的響應(yīng)有多種調(diào)控系統(tǒng)的參與，例如鹽脅迫條件下，Hik2、Hik16、Hik33、Hik34、Hik36、Hik41、Hik43、Rre1、Rre6、SigB和Yfr1等均參與到了適應(yīng)性調(diào)控過程中基因表達(dá)的不同階段。因此，在進(jìn)行調(diào)控工程時(shí)可將多種調(diào)控系統(tǒng)元件進(jìn)行耦合，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)代謝過程同時(shí)進(jìn)行調(diào)控［圖5（c）］。比如，在集胞藻PCC 6803中對(duì)丁醇耐受性的研究中，sRNA與TCS系統(tǒng)均參與到調(diào)控過程［67］，通過對(duì)兩個(gè)調(diào)控系統(tǒng)的同時(shí)干預(yù)，極大地提高了丁醇的耐受性。與丁醇耐受調(diào)控過程相同，在鹽脅迫、高光脅迫或氧化脅迫環(huán)境條件下，有不同調(diào)控系統(tǒng)的參與，對(duì)這些調(diào)控系統(tǒng)單元進(jìn)行合理的組合適配有望進(jìn)一步提高菌株耐受性。

表1 藍(lán)細(xì)菌中調(diào)控系統(tǒng)及功能Tab.1 Functions of regulatory system units in cyanobacteria

圖5 調(diào)控工程展望總結(jié)Fig.5 Prospect of regulatory engineering research

以光合藍(lán)細(xì)菌為底盤進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)，產(chǎn)品產(chǎn)量提高的同時(shí)會(huì)抑制底盤生長導(dǎo)致單位培養(yǎng)體積產(chǎn)品產(chǎn)量降低［120-121］，影響碳平衡和能量平衡。而調(diào)控系統(tǒng)參與光合系統(tǒng)電子鏈與碳固定的平衡調(diào)節(jié)，如RblR［61］。因此，可以通過調(diào)控工程優(yōu)化電子鏈與碳固定之間關(guān)系，優(yōu)化生長與生產(chǎn)之間的關(guān)系?？刹扇∩L與生產(chǎn)分離的策略，引入群體感應(yīng)系統(tǒng)，在生長初期能量和碳源僅供底盤生長，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，激活生產(chǎn)模塊，此時(shí)大量的能量和碳源流向產(chǎn)品，使產(chǎn)量達(dá)到最大。此外，活性氧（ROS）在多種脅迫環(huán)境下產(chǎn)生，如高光、鹽以及銅離子缺乏等［15，22］。脅迫環(huán)境下ROS升高可能是脅迫環(huán)境對(duì)菌株抑制的主要毒性體現(xiàn)，因此ROS積累問題是增加多種耐受性的潛在靶點(diǎn)。氧化還原調(diào)控過程有多種調(diào)控系統(tǒng)的參與，這些調(diào)控系統(tǒng)具有非常大的潛力降低ROS積累，進(jìn)而提高菌株耐受性。

使用調(diào)控工程，開發(fā)多元抗逆藍(lán)細(xì)菌底盤。為滿足工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境需求，提高藍(lán)細(xì)菌在多元耐受條件下的耐受性，開發(fā)多元耐受的藍(lán)細(xì)菌底盤是必不可少的工作。針對(duì)多元耐受藍(lán)細(xì)菌底盤開發(fā)工作，構(gòu)建智能抗逆藍(lán)細(xì)菌底盤［20，109，122］。針對(duì)已知作用的調(diào)控系統(tǒng)元件，借助人工智能對(duì)光合藍(lán)細(xì)菌調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)組合，并與實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化相結(jié)合，進(jìn)行多元耐受底盤的開發(fā)。

3.4 調(diào)控系統(tǒng)的蛋白質(zhì)工程

在調(diào)控系統(tǒng)中，許多蛋白參與調(diào)控過程，因此通過蛋白工程，對(duì)調(diào)控蛋白進(jìn)行改造，如圖5（e）所示，設(shè)計(jì)滿足研究者需要的蛋白是進(jìn)一步推進(jìn)調(diào)控工程的重要步驟。對(duì)編碼σ因子、調(diào)控蛋白和RNA聚合酶等與調(diào)控相關(guān)的基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR建庫后篩選相關(guān)表型的非理性蛋白質(zhì)改造的工作目前已經(jīng)取得一定成果［19，70-73，123-124］。而調(diào)控系統(tǒng)蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)是未來發(fā)展的重要方向。將機(jī)器學(xué)習(xí)與調(diào)控蛋白工程相結(jié)合，通過機(jī)器學(xué)習(xí)引導(dǎo)調(diào)控蛋白的工程改造，優(yōu)化蛋白質(zhì)功能，是未來發(fā)展趨勢(shì)之一［125］。近年來，使用蛋白質(zhì)工程對(duì)天然蛋白進(jìn)行改造提高酶活性、增強(qiáng)酶穩(wěn)定性、擴(kuò)大酶譜成為了一種重要方法［126］。將機(jī)器學(xué)習(xí)與蛋白進(jìn)化相結(jié)合，對(duì)調(diào)控蛋白進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)調(diào)控蛋白的可編程，是未來調(diào)控工程的一個(gè)發(fā)展方向。

3.5 系統(tǒng)調(diào)控工程

系統(tǒng)調(diào)控工程是以多方面多層次工程改造細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)的方式，對(duì)菌株全局代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)整的技術(shù)概念。調(diào)控工程的初級(jí)目標(biāo)是能夠人工設(shè)計(jì)調(diào)控系統(tǒng)單元，對(duì)既定靶標(biāo)進(jìn)行直接作用。隨著要求的提高，調(diào)控系統(tǒng)工程以不同條件下的代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝流分析等大量組學(xué)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建光合藍(lán)細(xì)菌調(diào)控系統(tǒng)與代謝網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系模型，對(duì)調(diào)控系統(tǒng)變化后的代謝模式進(jìn)行預(yù)測(cè)，在全局范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)的人工設(shè)計(jì)。光系統(tǒng)能夠接受光強(qiáng)信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)［15］，適應(yīng)不同光照強(qiáng)度，而暗反應(yīng)過程主要利用光系統(tǒng)產(chǎn)生的能量將CO2固定。最近有文章報(bào)道，光亦能調(diào)控卡爾文循環(huán)過程［127］。光系統(tǒng)效率與碳固定系統(tǒng)相比要高得多，在高光條件下往往需要光系統(tǒng)通過各種形式耗散多余的能量，避免光系統(tǒng)受到損傷。近來有研究表明，通過引入異源合成途徑能夠有效提高光系統(tǒng)效率，在一定程度上降低光損傷［128］。因此，平衡光系統(tǒng)與碳固定系統(tǒng)對(duì)于光合效率的提高有重要意義，如圖5（d）所示。光信號(hào)可以調(diào)控光系統(tǒng)與碳固定系統(tǒng)，引入異源途徑，將異源途徑的表達(dá)與內(nèi)源響應(yīng)光信號(hào)的調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行嵌合，使異源途徑接受光信號(hào)調(diào)控，進(jìn)而提高光合藍(lán)細(xì)菌高光適應(yīng)能力以及光合效率。在上述調(diào)控系統(tǒng)得到充分解析的情況下，結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)，未來有望實(shí)現(xiàn)基于調(diào)控工程的細(xì)胞全局調(diào)控，平衡光反應(yīng)與暗反應(yīng)之間的關(guān)系。

4 總結(jié)

調(diào)控工程是提高底盤耐受性，優(yōu)化底盤生長與產(chǎn)品產(chǎn)量，促進(jìn)光合藍(lán)細(xì)菌底盤商業(yè)化的可行方法。當(dāng)前，利用調(diào)控工程對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量、耐受性以及生長進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，使三者關(guān)系達(dá)到最優(yōu)，還具有一定的難度。因此，要加強(qiáng)調(diào)控系統(tǒng)元件功能研究工作，刻畫光合藍(lán)細(xì)菌調(diào)控系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，與機(jī)器學(xué)習(xí)等先進(jìn)科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)快速高效的遺傳操作技術(shù)，以及微流控等高通量篩選技術(shù)，加快調(diào)控系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的研究工作。在當(dāng)前研究基礎(chǔ)上，加快已知功能的調(diào)控系統(tǒng)單元轉(zhuǎn)化，將不同調(diào)控系統(tǒng)元件進(jìn)行耦合。同時(shí)，積極結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)，對(duì)調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行模型構(gòu)建，對(duì)調(diào)控系統(tǒng)單元變化進(jìn)行預(yù)測(cè)，修復(fù)調(diào)控系統(tǒng)模型，以求能實(shí)現(xiàn)對(duì)調(diào)控模型的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。綜上，未來可望通過調(diào)控系統(tǒng)工程進(jìn)一步的工作，推動(dòng)具備規(guī)?；瘧?yīng)用潛力的藍(lán)細(xì)菌底盤的構(gòu)建，促進(jìn)CO2的資源化利用，助力國家“碳達(dá)峰”及“碳中和”目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。