劉佳，智慧，艾丹，楊秀華

（呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000）

0 引言

益母草又名茺蔚，為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鮮或干燥地上部分[1]。益母草藥材中含有豐富的藥用活性成分，包括生物堿類益母草堿、鹽酸水蘇堿，二萜類成分前益母草素、益母草素、前益母草素，揮發(fā)油類成分麝香草油、苦艾油，黃酮類成分蘆丁、槲皮素，動(dòng)物多糖有淀粉、纖維素、果聚糖、半纖維素等，植物多糖有糖原、甲殼素、肝素等[2]。據(jù)中國(guó)藥典記載，鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿作為益母草質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。熊鶯等人研究結(jié)果顯示鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿是益母草藥材中主要的活性成分[3-4]，其中鹽酸益母草堿藥理作用廣泛。有研究表明，鹽酸益母草堿可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)并改善軟骨降解[5]；也可通過(guò)AMPK / SREBP1信號(hào)通路對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪性肝炎具有保護(hù)作用[6]；張怡等[7]研究發(fā)現(xiàn)益母草中的成分鹽酸益母草堿能夠抑制破骨細(xì)胞生成。趙懿清等[8]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸益母草堿能夠抑制大鼠子宮的異常出血。

益母草在全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)江蘇、廣東、廣西、福建、貴州、云南、四川、內(nèi)蒙古等地[9]。各地區(qū)在益母草的采收時(shí)期方面說(shuō)法不一，缺乏有效依據(jù)，從而導(dǎo)致不同批次生產(chǎn)的含有益母草單位藥材的成分含量不均一，影響了藥品的品質(zhì)。呼倫貝爾地區(qū)益母草花期為7-9月，果期為9月[10]，結(jié)合呼倫貝爾市氣候特點(diǎn)和益母草長(zhǎng)勢(shì)情況，本研究選定從8月中旬至10月中旬之間的益母草樣品作為本次研究對(duì)象，對(duì)其活性成分鹽酸益母草堿進(jìn)行了含量測(cè)定比較研究，以期為最佳采收時(shí)期的確定提供可參考的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀：日本島津LC-15C輸液泵、SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-15C紫外檢測(cè)器、SCL-10AVP工作站；KQ500-DB數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；BSA124S電子天平（Max=120g，d=0.1mg）賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 材料

鹽酸益母草堿（純度≥98%，批號(hào)：AF21072351,城都埃法生物科技有限公司）、辛烷磺酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、乙腈為色譜純（山東禹王和天下新材料有限公司）、無(wú)水乙醇為分析純（山東禹王和天下新材料有限公司）、水為超純水。

以益母草的種植馴化文獻(xiàn)為依據(jù)，采集2021年8月15日、8月30日、9月15日、9月30日、10月15日等五個(gè)不同時(shí)期的益母草樣品，晾干，在干燥陰涼處保存?zhèn)溆?。樣品采集自呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院蒙藥材馴化栽培實(shí)訓(xùn)基地。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液（45：55）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為277nm；進(jìn)樣量：10μL

2.2 供試品溶液的制備

取益母草樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸益母草堿對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

精密量取鹽酸益母草堿對(duì)照品1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分別置于10 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取上述溶液10μL 進(jìn)樣，按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量X（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得回歸方程為：y = 66933x + 10915，R2 = 0.9999，結(jié)果表明鹽酸益母草堿進(jìn)樣量在0.003～0.015mg范圍與峰面積具有良好的線性關(guān)系；精密吸取鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液10μL，按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得鹽酸益母草堿對(duì)照品的峰面積積分值，結(jié)果RSD值為0.78%，試驗(yàn)表明，儀器精密度良好；取2021年8月15日、9月1日、9月15日、9月30日和10月15日采集的益母草供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10小時(shí)進(jìn)樣10μL，結(jié)果RSD值依次為0.81%、0.76%、0.59%、0.65%、0.77%，表明供試品溶液在10小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好；按照“2.2”項(xiàng)平行制備2021年8月15日、9月1日、9月15日、9月30日和10月15日采集的益母草供試品，每樣6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10μL，結(jié)果RSD值依次為1.21%、0.98%、1.05%、1.45%、1.56%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 結(jié)果

2.5.1 對(duì)照品含量測(cè)定

精密吸取按2.3項(xiàng)下配制的鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液，取10μL注入高效液相色譜儀測(cè)得，見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸益母草堿對(duì)照品HPLC

2.5.2 供試品含量測(cè)定

分別取于2021年8月15日、9月1日、9月15日、9月30日和10月15日采集的益母草樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行鹽酸益母草堿的含量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示蒙藥益母草中鹽酸益母草堿含量最高的是2021年8月15日采集的樣品，含量為0.1334%，其次依次為9月1日、9月15日、9月30日和10月15日等時(shí)間采集的益母草樣品，依次為0.0867%、0.0821%、0.0797%、0.0787%。結(jié)果顯示，蒙藥益母草在8月中旬的開花初期時(shí)鹽酸益母草堿的含量為最高，其他時(shí)期含量均顯示下降趨勢(shì)。圖2為8月15日采集樣品色譜圖、圖3為9月1日采集樣品色譜圖、圖4為9月15日采集樣品色譜圖、圖5為9月30日采集樣品色譜圖、圖6為10月15日采集樣品色譜圖。表1為不同采收時(shí)期蒙藥益母草中有效成分含量的測(cè)定結(jié)果。

表1 不同采收時(shí)期蒙藥益母草中有效成分含量的比較

圖2 8月15日采集益母草樣品HPLC

圖3 9月1日采集益母草樣品HPLC

圖4 9月15日采集益母草樣品HPLC

圖5 9月30日采集益母草樣品HPLC

圖6 10月15日采集益母草樣品HPLC

3 討論

蒙醫(yī)臨床上益母草具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，主治肝熱、目赤腫痛、眼白斑、云翳、結(jié)膜炎等[11]。郭巧技等人[12]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收階段益母草中有效成分進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)期益母草質(zhì)量最好，其次是童子期，花期及果期質(zhì)量最差。周穎等人[13]研究發(fā)現(xiàn)，益母草在過(guò)了花盛期，莖稈呈枯黃、葉片缺失，有效成分鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿含量下降。本研究通過(guò)規(guī)范種植蒙藥材益母草，根據(jù)文獻(xiàn)記載的益母草采收期結(jié)合本地區(qū)益母草長(zhǎng)勢(shì)于2021年8月15日、8月30日、9月15日、9月30日、10月15日等五個(gè)不同時(shí)期采集益母草樣品，以2020年版《中國(guó)藥典》為依據(jù)，對(duì)益母草樣品中的鹽酸益母草堿含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示8月15日采集到的益母草樣品中的鹽酸益母草含量最高，為0.1334%，10月15日期采集到的益母草樣品中的鹽酸益母草樣品含量最低，為0.7873。

綜上所述，益母草藥材不同時(shí)期采收的有效成分含量存在差異，其中呼倫貝爾地區(qū)8月中旬采收的樣品中有效成分含量最高，建議在此期間采收為宜。