釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性測定*

王益娜，陳碧環(huán)，郭兆寬，劉祥宇，張廣輝，楊生超

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

1996 年，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S288C 菌株)的基因組成為第1 個完全測序的真核基因組，對基因組組織和進化等具有重要意義[1]。作為一種廣為人知的傳統(tǒng)模式酵母，釀酒酵母具有產(chǎn)物安全性、豐富的基因編輯工具且容易操作，在工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用；與細菌、其他酵母和絲狀真菌相比，釀酒酵母對寬pH 范圍、高濃度乙醇、糖以及高滲透壓的耐受性使其成為與工業(yè)乙醇相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)的首選宿主[2-4]。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種二態(tài)、非致病的非常規(guī)產(chǎn)油酵母[5]，因其高分泌能力、強大的乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 通量[6-8]、大量的遺傳工具[9-10]以及安全性[11]而受到全世界的關(guān)注。解脂耶氏酵母能在正構(gòu)烷烴上生長并產(chǎn)生高水平的有機酸(如檸檬酸)以及大量異源蛋白質(zhì)和代謝物[12-13]，被廣泛用于重組蛋白、赤蘚糖醇、檸檬酸和脂類等工業(yè)生產(chǎn)[14-15]。該酵母只能使用有限范圍的C6 糖(如葡萄糖、果糖和甘露糖)[16]，但它可以利用醋酸酯、醇和疏水底物(包括油、烷烴和脂肪酸)；作為專性需氧菌，該酵母對氧氣濃度非常敏感，是影響其生命周期生長和代謝的重要因素；其適宜的生長溫度應(yīng)低于32～34 ℃[17]，與釀酒酵母相比，解脂耶氏酵母是一種Crabtree陰性酵母，不會產(chǎn)生乙醇，適合高密度發(fā)酵[18]。

芳香族化合物及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品、聚合物、營養(yǎng)品和制藥等行業(yè)，其主要來源是石油資源。石油資源的過度開發(fā)及消費導(dǎo)致三大能源日益枯竭，污染日益嚴重[19]。人們通過構(gòu)建微生物細胞工廠作為石油資源的替代來源，利用大腸桿菌和酵母等模式生物，以廉價的碳源或前體為底物生產(chǎn)芳香族化合物及其衍生物[20]。對香豆酸、對羥基苯丙酸、阿魏酸、咖啡酸和肉桂酸是許多具有商業(yè)價值的化學(xué)品的前體，其生物合成途徑是生產(chǎn)芳香族化合物的核心代謝途徑之一，同時也是生物合成多種天然產(chǎn)物(如黃酮類和生物堿)的主要底物[21]。然而，關(guān)于工程菌對不同酚酸類小分子物質(zhì)的耐受性研究仍不夠全面，目前還沒有文獻報道釀酒酵母和解脂耶氏酵母對酚酸類小分子物質(zhì)的耐受性。本研究系統(tǒng)比較了釀酒酵母和解脂耶氏酵母對對羥基苯丙酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的耐受性，以期為芳香族化合物及其衍生物的合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株包括釀酒酵母W303 和解脂耶氏酵母W29，均由中國科學(xué)院天津生物工業(yè)研究所保存。

1.2 試驗試劑與儀器

酵母提取物(OXOID 公司)，蛋白胨(OXOID公司)，對羥基苯丙酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸樣品(純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司)，DMSO (北京索萊寶科技有限公司)；實時微生物生長曲線分析儀[杰靈儀器制造(天津)有限公司]，高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ602 型)，恒溫培養(yǎng)搖床(北京億諾生物科技有限公司)，電子天平(上海梅特勒-托利多公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 YPD 液體培養(yǎng)基的制備

稱量葡萄糖20 g、蛋白胨20 g 和酵母提取物10 g，溶于水中并定容至1 L，115 ℃滅菌20 min后制得。

1.3.2 種子液制備

將-80 ℃保存的甘油菌劃線于固體YPD 平板中活化菌種，從平板中挑1 個單克隆接種于含有3 mL YPD 液體培養(yǎng)基的15 mL 試管中，于30 ℃、220 r/min 搖菌48 h 得到種子液。

1.3.3 不同濃度酚酸樣品的配制

對羥基苯丙酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸底物配制初始濃度為2 mol/L 的母液，分別溶于DMSO 溶液后再稀釋為1 mol/L 以及500、400、300、200、100 和50 mmol/L 等不同濃度。

1.3.4 釀酒酵母和解脂耶氏酵母細胞生長曲線的測定

用移液槍取1.3.2 節(jié)制備的種子液20 μL，將其加入含有YPD 液體培養(yǎng)基480 μL 的48 孔板中，每個樣品3 個生物學(xué)重復(fù)；將孔板置于實時微生物生長曲線分析儀中，溫度設(shè)置為30 ℃，每2 h 測定1 次OD600值，連續(xù)測定24 h。測定完成后記錄數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標、OD600值為縱坐標繪制生長曲線圖。

1.3.5 釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸耐受性的測定

在48 孔板中加入YPD 液體培養(yǎng)基477.5 μL，并分別接種釀酒酵母和解脂耶氏酵母種子液20 μL，再分別加入不同濃度的酚酸樣品2.5 μL，使酚酸的終濃度為5.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50 和0.25 mmol/L，每個樣品3 個生物學(xué)重復(fù)。設(shè)置2 組空白對照組，一組加入DMSO 溶液2.5 μL，另一組加入無菌水2.5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母和解脂耶氏酵母的生長曲線

由圖1 可知：解脂耶氏酵母培養(yǎng)6 h 后進入對數(shù)生長期，18 h 后趨于平穩(wěn)；釀酒酵母生長緩慢，在48 h 后才進入平穩(wěn)期。此外，解脂耶氏酵母的細胞OD600值可達6，而釀酒酵母的最大OD600值僅為解脂耶氏酵母的一半。

圖1 釀酒酵母和解脂耶氏酵母細胞的生長曲線Fig.1 Cell growth curve of Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica

2.2 釀酒酵母對不同酚酸的耐受性

由圖2 可知：5.00 mmol/L 對羥基苯丙酸和咖啡酸處理的OD600值與對照相比無顯著差異，表明釀酒酵母可以耐受該濃度的對羥基苯丙酸和咖啡酸；5.00 mmol/L 對香豆酸可顯著影響釀酒酵母生長，表明其對釀酒酵母有毒性；隨著阿魏酸濃度的增大，釀酒酵母的OD600值減小，0.25 mmol/L阿魏酸即可顯著影響釀酒酵母生長，當阿魏酸濃度為5.00 mmol/L 時，最大OD600值為1.5，而對照的最大OD600值為5.0，表明釀酒酵母不能耐受濃度為5.00 mmol/L 的阿魏酸；0.50 mmol/L 肉桂酸即可顯著影響釀酒酵母生長，當肉桂酸濃度為5.00 mmol/L 時，釀酒酵母已經(jīng)完全不能生長。結(jié)果表明釀酒酵母對不同酚酸的耐受性表現(xiàn)為對羥基苯丙酸=咖啡酸＞對香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸。

圖2 釀酒酵母對不同酚酸的耐受性Fig.2 Tolerance of S.cerevisiae to different phenolic acids

2.3 解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性

由圖3 可知：5.00 mmol/L 對羥基苯丙酸和咖啡酸處理的OD600值與對照相比無顯著差異，表明解脂耶氏酵母可以耐受該濃度的對羥基苯丙酸和咖啡酸；5.00 mmol/L 對香豆酸對解脂耶氏生長有顯著的影響，該濃度下最大OD600值為4，而對照的最大OD600值為6，表明5.00 mmol/L 對香豆酸的毒性較小；5.00 mmol/L 的阿魏酸和肉桂酸均可顯著影響解脂耶氏酵母生長，且該濃度下，阿魏酸和肉桂酸處理的最大OD600值均為2，而對照的OD600值均為6，表明解脂耶氏酵母不能耐受濃度為5.00 mmol/L 的阿魏酸和肉桂酸；此外，0.25 mmol/L 肉桂酸、1.50 mmol/L 阿魏酸即可顯著影響解脂耶氏酵母生長。結(jié)果表明解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性表現(xiàn)為對羥基苯丙酸=咖啡酸＞對香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸。

圖3 解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性Fig.3 Tolerance of Y.lipolytica to different phenolic acids

總體來看，解脂耶氏酵母對不同酚酸的總體耐受性大于釀酒酵母。如：0.25 mmol/L 阿魏酸可顯著影響釀酒酵母生長，而1.50 mmol/L 阿魏酸可顯著影響解脂耶氏酵母生長；2.50 mmol/L肉桂酸可完全抑制釀酒酵母生長，而解脂耶氏酵母在5.00 mmol/L 肉桂酸處理下仍可生長，可見，解脂耶氏酵母更適合生產(chǎn)肉桂酸衍生化合物。

3 討論

目前，已有很多利用微生物進行天然產(chǎn)物異源生產(chǎn)的研究。常用的異源表達系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母和枯草芽孢桿菌，但由于原核表達系統(tǒng)缺少翻譯后加工過程，使得異源表達的酶活性受到一定的影響，因此，酵母作為真核生物得到了廣泛的研究和應(yīng)用[22-23]。國外已有研究通過一系列代謝工程策略從釀酒酵母中產(chǎn)生25 g/L 青蒿酸，這是合成生物學(xué)領(lǐng)域的開創(chuàng)性成果[24]；國內(nèi)研究人員也在人參皂苷異源生產(chǎn)中通過改造酵母菌株生產(chǎn)出5.74 g/L 人參皂苷CK[25]。但是，與萜烯類和生物堿類天然產(chǎn)物相比，黃酮類化合物的擴大培養(yǎng)效果不佳，在發(fā)酵罐中達不到理想的產(chǎn)量[26]。

前體小分子自身的毒性作用給黃酮類化合物的大量生產(chǎn)帶來困難。本研究通過分析酚酸類小分子對釀酒酵母和解脂耶氏酵母的毒性發(fā)現(xiàn)：2 種酵母對不同酚酸的耐受性有差異，解脂耶氏酵母對酚酸的總體耐受性大于釀酒酵母，且更適合生產(chǎn)肉桂酸衍生化合物，但2 種酵母對不同酚酸的耐受性基本一致。本研究中，解脂耶氏酵母對對香豆酸的耐受性研究結(jié)果與PALMER 等[27]的研究報道一致。已有報道沒有全面比較釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性研究，本研究通過比較這2 種酵母對不同酚酸的耐受性，為宿主的選擇提供了依據(jù)；同時可以利用耐受性的差異特性，通過更換不同的底盤酵母達到較高的生產(chǎn)水平，從而進一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本研究可以為解析酚酸類小分子抑制機制提供參考，也可為進一步提高芳香氨基酸衍生物在酵母中的合成效率提供新思路。

4 結(jié)論

釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性趨勢一致，均表現(xiàn)為對羥基苯丙酸=咖啡酸＞對香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸，且解脂耶氏酵母對酚酸的耐受性大于釀酒酵母。解脂耶氏酵母更適合用于生產(chǎn)芳香氨基酸衍生物，尤其是肉桂酸類衍生物的生物合成。