孟紫君，何 璇，龐彩鳳，劉春萍，黃春艷，陳文霞

牙髓是高度血管化的組織，被堅(jiān)硬的無讓性牙本質(zhì)包圍，血管、神經(jīng)、淋巴管僅通過狹窄的根尖孔與根尖周組織相連，這種獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)使牙髓在受到損傷后易發(fā)生缺血缺氧甚至感染壞死[1]。傳統(tǒng)的根管治療會(huì)導(dǎo)致牙齒變脆，增加根折的風(fēng)險(xiǎn)。人牙髓干細(xì)胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，能夠再生受損的細(xì)胞和牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，基于干細(xì)胞移植的組織工程技術(shù)是牙髓疾病理想的治療方式[2]。組織工程技術(shù)的成功依賴于良好血管網(wǎng)絡(luò)的建立，這對(duì)維持牙髓組織的活力和功能至關(guān)重要。而如何提高干細(xì)胞的血管生成潛能，以有效再生功能性牙髓組織是臨床上尚未解決的難題。有研究表明，缺氧環(huán)境能夠提高干細(xì)胞的促血管生成潛能，主要是通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，從而激活HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)途徑來調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)和分泌[3]，但具體的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制尚未明確。miRNA是一類長度為17～24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯過程，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]。miR-143-5p作為干細(xì)胞功能和分化的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控干細(xì)胞向牙本質(zhì)分化和缺氧環(huán)境下的血管生成[5-6]?；驍?shù)據(jù)庫分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1α為miR-143-5p靶基因之一[7]，但低氧環(huán)境下miR-143-5p對(duì)人牙髓干細(xì)胞促血管生成潛能的調(diào)控作用尚不清楚。本研究以人牙髓干細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察miR-143-5p對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)化學(xué)缺氧人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)活性和促血管生成潛能的影響，并探討miR-143-5p/HIF-1α信號(hào)軸在其中的作用。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco，美國)；青霉素鏈霉素混合液(索萊寶，中國)；氯化鈷六水合物(Sigma，美國)；過表達(dá)miR-143-5p慢病毒(miR-143-5p mimics)載體、過表達(dá)陰性對(duì)照(mimics-NC)載體、沉默miR-143-5p慢病毒(miR-143-5p inhibitor)載體、沉默陰性對(duì)照(inhibitor-NC)載體(吉?jiǎng)P基因，中國)；PCR試劑盒(Takara，中國)；鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人HIF-1α多克隆抗體(Elabscience，中國)；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(Invitrogen，美國)；CCK-8試劑盒(Dojindo，中國)；BCA試劑盒(碧云天，中國)；ELISA試劑盒(Elabscience，中國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人牙髓干細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)：采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞。經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，臨床收集15～25歲因正畸需要拔除的健康前磨牙，受試者及家屬均知情同意。在無菌環(huán)境下劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼科剪將牙髓剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，均勻的鋪在培養(yǎng)瓶底部，然后加入高糖DMEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清，1%青鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3 d換液1次，至細(xì)胞生長至80%融合時(shí)用0.25%胰酶消化，以1∶3傳代。取生長狀態(tài)良好的第3～5代人牙髓干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞表面標(biāo)志物：人牙髓干細(xì)胞生長至80%～90%融合后，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106/ml；兩支流式樣品管各取100 μl的細(xì)胞懸液，在陽性管內(nèi)依次加入20 μl的CD45、CD29、CD34、CD90抗體，陰性管內(nèi)加入80 μl的PBS溶液，冰上避光孵育30 min。PBS洗脫未結(jié)合的抗體，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3氯化鈷構(gòu)建體外細(xì)胞化學(xué)缺氧模型：配制含不同濃度氯化鈷的DMEM培養(yǎng)液處理人牙髓干細(xì)胞24 h或48 h，根據(jù)氯化鈷終末濃度將實(shí)驗(yàn)組分為50、100、200 μmol/L組，對(duì)照組氯化鈷終末濃度為0 μmol/L。利用氯化鈷的化學(xué)特性，模擬體外細(xì)胞缺氧環(huán)境。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞增殖能力：將人牙髓干細(xì)胞以3000個(gè)每孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄上清，根據(jù)上述分組加入100 μl含不同濃度氯化鈷的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24 h和48 h。向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在450 nm處的吸光度值。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞遷移能力：取生長狀態(tài)良好的人牙髓干細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，往上室每孔加入200 μl(1×105/ml)單細(xì)胞懸液，根據(jù)上述分組在下室加入700 μl含不同濃度氯化鈷的完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛室溫下固定20 min。用棉簽擦去小室微孔膜上層細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。雙蒸水漂洗，顯微鏡下觀察并記錄遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6人牙髓干細(xì)胞miR-143-5p及血管生成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)總RNA的純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)擴(kuò)增反應(yīng)。miR-143-5p內(nèi)參為U6，HIF-1α、VEGF內(nèi)參為β-actin。采用2-ΔΔCt法分析目的基因表達(dá)情況。引物序列見表1。

1.2.7Western Blot檢測(cè)氯化鈷對(duì)人牙髓干細(xì)胞表達(dá)HIF-1α的影響：將細(xì)胞充分裂解，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉15 min，TBST洗滌5次，每次5 min。加入一抗HIF-1α(1∶1000)、β-actin(1∶2000)在4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗滌5次。分別加入山羊抗兔(1∶5000)和山羊抗鼠二抗溶液(1∶10000)室溫下孵育1 h；洗膜，ECL顯色，暗室曝光。ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8ELISA檢測(cè)氯化鈷對(duì)人牙髓干細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組人牙髓干細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h和48 h后，取上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中VEGF的濃度。ELISA檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。

1.2.9構(gòu)建慢病毒載體過表達(dá)或沉默人牙髓干細(xì)胞miR-143-5p：將人牙髓干細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至30%～50%融合時(shí)，按照吉?jiǎng)P基因慢病毒轉(zhuǎn)染操作說明書分別轉(zhuǎn)染miR-143-5p mimics、mimics-NC、miR-143-5p inhibitor、inhibitor-NC載體至人牙髓干細(xì)胞。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞miR-143-5p與成血管生成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)3～7 d后人牙髓干細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，呈長梭形、紡錘樣形態(tài)，有少量細(xì)胞突起。見圖1a。14～20 d后人牙髓干細(xì)胞基本長滿瓶底，以胰蛋白酶消化傳代。傳代的細(xì)胞密度顯著增加，表現(xiàn)為集落樣克隆增長，呈放射狀或旋渦狀排列。見圖1b。

表1 miR-143-5p及血管生成相關(guān)基因引物序列

圖1 人牙髓干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

1a.人牙髓干細(xì)胞原代培養(yǎng)第5天(×40)；1b.第3代人牙髓干細(xì)胞(×100)

2.2人牙髓干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定 流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其中CD29(100.00%)和CD90(98.50%)呈陽性表達(dá)；造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34(0.43%)和CD45(0.15%)呈陰性表達(dá)；符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原特征，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為人牙髓干細(xì)胞。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞表面標(biāo)志物

2.3不同濃度氯化鈷處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h和48 h后，50 μmol/L組和100 μmol/L組細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。200 μmol/L組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度氯化鈷對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖的影響

2.4不同濃度氯化鈷處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，50 μmol/L組、100 μmol/L組和200 μmol/L組細(xì)胞遷移能力均高于對(duì)照組，且100 μmol/L組和200 μmol/L組高于50 μmol/L組(P<0.01)。見圖4。

圖4 不同濃度氯化鈷對(duì)人牙髓干細(xì)胞遷移能力的影響(×100)

2.5miR-143-5p及HIF-1α、VEGF mRNA在缺氧誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h后，50 μmol/L組、100 μmol/L組和200 μmol/L組miR-143-5p表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，并隨氯化鈷濃度的升高而降低(P<0.01)。相反，50 μmol/L組、100 μmol/L組和200 μmol/L組HIF-1α mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，且200 μmol/L組較100 μmol/L組顯著升高(P<0.01)。100 μmol/L組和200 μmol/L組VEGF mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 不同濃度氯化鈷處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞miR-143-5p及成血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6不同濃度氯化鈷處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的影響 在氯化鈷誘導(dǎo)48 h后，人牙髓干細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平隨氯化鈷濃度的增加逐漸升高，100 μmol/L組和200 μmol/L組HIF-1α蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。見圖6a、6b。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h和48 h后，100 μmol/L組和200 μmol/L組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，并隨時(shí)間的延長和氯化鈷濃度的增加而增加。見圖6c。

圖6 不同濃度氯化鈷處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

2.7miR-143-5p對(duì)人牙髓干細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的影響 用慢病毒載體過表達(dá)或沉默人牙髓干細(xì)胞中miR-143-5p，并檢測(cè)HIF-1α、VEGF mRNA水平。熒光顯微鏡觀察與qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-143-5p mimics人牙髓干細(xì)胞miR-143-5p表達(dá)較轉(zhuǎn)染mimics-NC明顯升高(P<0.01)，表明慢病毒載體介導(dǎo)的miR-143-5p轉(zhuǎn)染有較高的轉(zhuǎn)染效率。與轉(zhuǎn)染mimics-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-143-5p mimics人牙髓干細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與轉(zhuǎn)染inhibitor-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-143-5p inhibitor人牙髓干細(xì)胞HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。表明miR-143-5p能夠負(fù)向調(diào)控HIF-1α/VEGF水平，促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的旁分泌血管生成活性。見圖7。

3 討論

由于牙髓腔解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，缺氧是牙髓內(nèi)常見的環(huán)境應(yīng)激因素，由生物或機(jī)械刺激引起的牙髓炎癥可使組織間液壓力增加導(dǎo)致細(xì)胞缺氧[8]。研究表明，缺氧可以誘發(fā)牙源性干細(xì)胞增殖、血管生成和礦化等反應(yīng)[9-11]。氯化鈷作為一種化學(xué)物質(zhì)，其中的二價(jià)鈷離子能夠有效抑制細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的降解，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞缺氧模型的研究[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氯化鈷誘導(dǎo)的化學(xué)缺氧環(huán)境下，50 μmol/L和100 μmol/L的氯化鈷能夠促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖，而50 μmol/L、100 μmol/L與200 μmol/L的氯化鈷能使細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，表明適宜的缺氧刺激能夠顯著提高人牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)活性，這對(duì)于干細(xì)胞遷移到損傷部位參與牙髓組織修復(fù)再生具有重要意義。

圖7 miR-143-5p在缺氧環(huán)境下對(duì)人牙髓干細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的影響

缺氧被認(rèn)為是刺激牙髓內(nèi)血管生成的重要因素。細(xì)胞在缺氧時(shí)能夠適應(yīng)缺氧環(huán)境并觸發(fā)血管生成反應(yīng)，與細(xì)胞內(nèi)升高的HIF-1α表達(dá)相關(guān)[13]。HIF-1α是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在常氧條件下HIF-1α被脯氨酸羥化酶羥基化，進(jìn)一步通過泛素化途徑降解；缺氧狀態(tài)下脯氨酸羥化酶被抑制，使HIF-1α累積，進(jìn)入細(xì)胞核后啟動(dòng)并參與細(xì)胞代謝、紅細(xì)胞生成和血管生成(如VEGF)等下游基因的轉(zhuǎn)錄，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著氯化鈷濃度的增加，HIF-1α和VEGF mRNA與蛋白表達(dá)水平逐漸升高，特別是在200 μmol/L氯化鈷缺氧誘導(dǎo)條件下，二者的表達(dá)與對(duì)照組比較差異更加顯著。眾所周知VEGF是最重要的促血管生成活性生長因子，能有效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、存活及分化為新生血管[15]。證實(shí)了缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞的旁分泌促血管生成活性顯著增強(qiáng)。

miRNA是一類內(nèi)生的、高度保守的小分子非編碼RNA，具有細(xì)胞和組織特異性，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用。此外，miRNA還參與了干細(xì)胞生物學(xué)過程，涉及細(xì)胞周期、干性維持和分化調(diào)節(jié)[16]。而miR-143-5p由于能夠調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)基因表達(dá)而受到廣泛關(guān)注。研究表明，miR-143-5p參與調(diào)控干細(xì)胞向內(nèi)皮分化和通過旁分泌作用的方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，如長鏈非編碼RNA TUG1通過調(diào)節(jié)miR-143/FGF1軸促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的內(nèi)皮分化[17]；GENG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈血清來源的外泌體能通過miRNA-143/IGF-IR途徑促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。此外，miR-143-5p通過負(fù)向調(diào)控靶基因HIF-1α表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤的血管生成，從而加快腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。但缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞是否表達(dá)miR-143-5p，以及miR-143-5p是否通過HIF-1α/VEGF軸調(diào)節(jié)缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞的促血管生成潛能尚不清楚。

本研究首先通過qRT-PCR證實(shí)了miR-143-5p在缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，說明缺氧能夠引起miR-143-5p表達(dá)的變化。然后探討缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞中miR-143-5p是否通過調(diào)控HIF-1α表達(dá)水平促進(jìn)了細(xì)胞的旁分泌促血管生成活性。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下miR-143-5p隨氯化鈷濃度的增加其表達(dá)逐漸下調(diào)，而HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平則在氯化鈷誘導(dǎo)后逐漸增高，二者呈反向變化關(guān)系。進(jìn)一步慢病毒載體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-143-5p能顯著降低人牙髓干細(xì)胞中HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平，而抑制人牙髓干細(xì)胞miR-143-5p的表達(dá)后，HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)則明顯升高。表明缺氧環(huán)境下miR-143-5p通過負(fù)向調(diào)控HIF-1α mRNA的表達(dá)來促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞分泌VEGF的能力，從而提高缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞的促血管生成潛能。

綜上所述，氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境促進(jìn)了人牙髓干細(xì)胞的增殖、遷移和促血管生成潛能等生物學(xué)特性，而miR-143-5p/HIF-1α信號(hào)軸可能參與了缺氧環(huán)境下對(duì)人牙髓干細(xì)胞旁分泌促血管生成活性的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)為缺氧環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞促血管生成潛能的分子機(jī)制相關(guān)研究提供了參考，但詳細(xì)機(jī)制尚需通過進(jìn)一步體外內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。