楊 靜，李書貴

(1.貴州省煙草公司黔東南州公司，貴州凱里 556000；2.黔東南州煙草公司施秉縣分公司，貴州施秉 562000)

煙葉中煙堿(nicotine)的含量占總植物堿含量的95%以上，是影響煙葉品質(zhì)的特征性指標(biāo)之一[1]。煙堿的含量與煙民的健康密切相關(guān)，含量過高可能會對身體健康產(chǎn)生嚴重危害[2]。近年來，隨著國內(nèi)外控?zé)熜蝿莸娜找鎳谰?，口含煙成為煙草工業(yè)企業(yè)的重要研究方向之一?？诤瑹煯a(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的重要指標(biāo)之一就是煙堿的釋放量[3]，同時煙堿對味覺具有很重要的影響，尤其在口含煙中，游離煙堿直接透過口腔黏膜被人體吸收，刺激人腦多巴胺的產(chǎn)生，從而增加人的滿足感[4]。在煙葉中煙堿含量偏高，導(dǎo)致放入口中使用時刺激性、辛辣味較重，煙堿含量的降低有利于降低煙草原料的辛辣感，從而改善口含煙的刺激感。有學(xué)者利用煙草土壤為試驗材料，從中篩選提取一株有效降解煙堿的微生物，并且進行了鑒定、確定其最佳生長條件及其降解煙堿最大的發(fā)酵條件，其降解率能達到82%[4-7]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，微生物對煙葉化學(xué)成分和評吸品質(zhì)有一定的影響，能夠降低煙葉煙堿含量，對提高香氣量、改善香氣質(zhì)有很好的作用[2，8-11]。現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，純種發(fā)酵占很大的比例[12]。但在長期的試驗和生產(chǎn)實踐中，人們不斷地發(fā)現(xiàn)很多重要生化過程僅靠單株微生物不能完成或只能微弱地進行，必須依靠2種或多種微生物共同培養(yǎng)來完成，即混菌培養(yǎng)或稱為混菌發(fā)酵。混菌發(fā)酵是采用2種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某發(fā)酵過程的一種新型發(fā)酵技術(shù)，是純種發(fā)酵技術(shù)的新發(fā)展，也是一種不需要進行復(fù)雜的DNA體外重組卻可取得類似效果的新型發(fā)酵技術(shù)。目前很多研究表明混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)品品質(zhì)明顯強于單一菌種發(fā)酵[13-19]。該研究通過以解淀粉芽孢桿菌GUHP86、枯草芽孢桿菌B01復(fù)合菌進行口含煙煙草原料發(fā)酵試驗，通過控制菌種比、接種量、有糖鹽溶液添加量，以發(fā)酵后煙堿含量為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵工藝，并對發(fā)酵后煙草原料進行感官品評，從嗅香、滿足感、口感特征、異味、口腔余香5個方面對發(fā)酵后煙草原料進行一個比較全面的評價，綜合評價混菌發(fā)酵口含煙煙草原料的煙堿含量及感官品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料解淀粉芽孢桿菌GUHP86、枯草芽孢桿菌B01來自貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院實驗室保藏菌株?？诤瑹煙煵菰线x用貴州省黔東南州煙區(qū)生產(chǎn)的云煙87上、中部葉片(B2F、C3F)。將葉片用水清洗掉表面的灰塵和雜質(zhì)后分別放入烘箱中在 40 ℃以下低溫烘干，粉碎密封保存。

1.2 菌株培養(yǎng)種子培養(yǎng)液：胰蛋白胨 0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化鈉2.5 g、葡萄糖 0.25 g、蒸餾水400 mL，加熱溶解，均等裝入小錐形瓶各20 mL，于121 ℃、20 min滅菌，取出冷卻。冷卻后，將培養(yǎng)好的菌株(在無菌操作臺中)分別加至小錐形瓶中，每瓶一株菌(液體保藏菌接2 mL)，蓋好，寫上標(biāo)簽，放入搖床中37 ℃培養(yǎng)12 h，用于第2天接菌進入煙葉。

1.3 煙葉發(fā)酵工藝

1.3.1制備種子液。準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g，加入1 000 mL容量瓶定容至刻度，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后接入菌種，180 r/min 37 ℃進行培養(yǎng)18 h，最終得到植物乳桿菌SQ-4種子液活菌濃度為9.52 CFU/mL、解淀粉芽孢桿菌GUHP86種子液活菌濃度為9.58 CFU/mL、枯草芽孢桿菌B01種子液活菌濃度為9.56 CFU/mL。

1.3.2煙草原料發(fā)酵工藝。圖1為煙葉的發(fā)酵工藝。用水將煙葉表面的灰塵和雜質(zhì)清洗后放入烘箱中在 40 ℃以下低溫烘干，打磨成粉，稱取20 g裝入14 cm×10 cm的無菌密封袋，滅菌備用。在無菌操作臺中將培養(yǎng)好的菌株分別放入均等的大離心管中，于8 000 r/min離心10 min。離心以后，傾倒出上清液，保留菌體，用已滅菌的生理鹽水20 mL加至此離心管中，搖勻。吸取適量離心管內(nèi)菌液于裝有已滅菌的煙粉塑封袋內(nèi)，適量加入鹽溶液，充分混勻，貼上標(biāo)簽放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)酵，每天需進行換氣。取樣時將煙粉在120 ℃滅菌20 min后冷凍保藏[20]。

圖1 煙葉的發(fā)酵工藝

1.4 單因素試驗

1.4.1不同菌種比接種發(fā)酵對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區(qū)生產(chǎn)的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料，分別稱取發(fā)酵煙草原料20 g，按1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1比例添加混合菌種6 mL，空白試驗不添加微生物添加4 mL有糖鹽溶液，每組混菌試驗添加有糖鹽溶液4 mL，在37 ℃下發(fā)酵15 d，將發(fā)酵后煙粉在 115 ℃下滅菌 20 min，測定其煙堿含量，并對其進行感官評價。

1.4.2不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區(qū)生產(chǎn)的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料，分別稱取發(fā)酵煙草原料20 g，按解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種，接菌量按3、4、5、6、7 mL添加，空白試驗不添加菌種添加4 mL有糖鹽溶液，每組混菌試驗添加有糖鹽溶液4 mL，在37 ℃下發(fā)酵15 d，將發(fā)酵后煙粉在115 ℃下滅菌20 min，測定其煙堿含量，并對其進行感官評價。

1.4.3有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區(qū)生產(chǎn)的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料，分別稱取發(fā)酵煙草原料20 g，按3、4、5、6、7 mL添加有糖鹽溶液，添加解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1混合菌種6 mL，空白試驗不添加有糖鹽溶液加入蒸餾水，在37 ℃下發(fā)酵15 d，將發(fā)酵后煙粉在115 ℃下滅菌 20 min，測定其煙堿含量，并對其進行感官評價。

1.4.4煙堿含量的測定方法。參照煙草行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)YC/T 468—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(硫氰酸鉀)法》[21]進行煙堿含量測定。

1.5 正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取菌種比、接種量和有糖溶液添加量作為因素進行L9(34)正交試驗，優(yōu)化口含煙混菌發(fā)酵工藝。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1不同菌種比接種發(fā)酵對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。由圖2可知，按照“1.4.1”的方法及條件進行試驗，添加菌種能夠明顯降低口含煙煙草原料中煙堿含量，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發(fā)酵時，煙堿含量最低(1.52%)，煙堿降解率最高(45.91%)，相對單菌發(fā)酵有所提高。同時當(dāng)解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發(fā)酵時，其感官評分最高，為92分，其綜合口感和香氣比較和諧(表1)。

表1 不同菌種比條件下感官評定結(jié)果

圖2 不同菌種比對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

2.1.2不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。試驗結(jié)果表明(圖3和表2)，接菌量對發(fā)酵后煙堿的降解率、原料的感官評價是有影響的，隨著接菌量的增加，發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量逐漸降低，當(dāng)接菌量為6 mL時，發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量最低(1.50%)，煙堿降解率最高(47.37%)，相對單菌發(fā)酵有所提高；當(dāng)接菌量超過6 mL 時煙堿降解率降低。同時從表2可以看出，當(dāng)接種量為6 mL時，其感官評分最高，為93分，嗅香、口腔余味提升。

表2 不同接菌量條件下感官評定結(jié)果

圖3 不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

2.1.3有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。從圖4可以看出，隨著有糖鹽溶液添加量的增加，發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量逐漸降低，當(dāng)有糖鹽溶液添加量為4 mL時，發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量最低(1.46%)，煙堿降解率最高(45.52%)，相對單菌發(fā)酵有所提高；當(dāng)有糖鹽溶液添加量高于4 mL時煙堿降解率降低。當(dāng)有糖鹽溶液添加量為4 mL時，其感官評分最高，為93分(表3)。

表3 不同有糖鹽溶液添加量條件下感官評定結(jié)果

圖4 有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

2.2 正交試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對口含煙煙草原料煙堿含量影響較大的 3 個因素，分別為菌種比、接菌量、有糖鹽溶液添加量，采用 L9(34)正交進行試驗設(shè)計。正交試驗因素與水平見表4，正交試驗結(jié)果見表5。

表4 正交試驗因素和水平

從表5可以看出，各因素對口含煙煙草原料混菌發(fā)酵降煙堿的影響程度不同，對煙草原料發(fā)酵感官評價影響也不同，從R值可以得出其影響順序均為A>B>C，即菌種比的影響最大，其次是接菌量，有糖鹽溶液添加量影響最小。從煙堿含量及感官評分得出最佳提取條件為A3B3C1，而根據(jù)k值分析得出的最佳提取條件組合為A3B2C1，因此要對這2個組合進行3組平行對比試驗，試驗結(jié)果如表6所示。通過驗證試驗對比，組合A3B2C1比組合A3B3C1發(fā)酵口含煙煙草原料降煙堿效果更好，感官評分更高，所以可以確定最優(yōu)組合為A3B2C1，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發(fā)酵，接菌量為6 mL、有糖鹽溶液添加量為4 mL 時，發(fā)酵口含煙煙草原料降煙堿效果更好，感官評價更優(yōu)。

表5 正交試驗結(jié)果

表6 驗證試驗對比

3 小結(jié)

煙堿是煙草最重要的化學(xué)成分之一，煙堿含量過高會影響口含煙產(chǎn)品的品質(zhì)，該研究采用解淀粉芽孢桿菌GUHP86與枯草芽孢桿菌B01對口含煙煙草原料進行混菌發(fā)酵，以發(fā)酵后煙堿含量和感官評分為指標(biāo)，通過監(jiān)測發(fā)酵過程中煙草原料中煙堿含量變化和感官評分確定混菌發(fā)酵的條件。結(jié)果表明，經(jīng)過混菌發(fā)酵后，口含煙煙草原料中煙堿含量在不同的菌種比、接菌量、有糖鹽溶液添加量條件下均發(fā)生了明顯的變化，在解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1、接種量為 6 mL、有糖鹽溶液添加量為4 mL 的條件下，37 ℃ 發(fā)酵15 d，口含煙煙草原料中煙堿含量達到最低值(1.53%)，發(fā)酵后口含煙煙草原料感官評分達到最高(94分)。這可能是發(fā)酵產(chǎn)生了一定活力的酶如蛋白酶，將煙葉中蛋白質(zhì)分解為一些具有特殊風(fēng)味的氨基酸參與微生物代謝，因此在感官上，加菌發(fā)酵煙葉較自然發(fā)酵煙葉整體更為協(xié)調(diào)，香味復(fù)雜濃烈，勁頭足，刺激性小，滋味更豐富[22]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵可以提高煙草中煙堿的降解率，降低煙葉有害物質(zhì)，提升煙葉質(zhì)量，提高食用舒適性，使煙葉整體香味更為諧調(diào)，為煙葉的混菌發(fā)酵技術(shù)開發(fā)提供一定的理論和技術(shù)參考。