生肌玉紅膏對血栓性脈管炎大鼠血管平滑肌細胞凋亡、炎性因子表達的影響及機制

王亞娜，宋曉聰，吳靜，崔羅方，劉麗，馬文華，趙秀雷，徐林麗，南桂英，王慧玲

1滄州醫(yī)學高等專科學校教研室，河北 滄州 061001；2滄州中心醫(yī)院外科；3滄州醫(yī)學高等?？茖W校內科護理教研室

血栓性靜脈炎是淺表靜脈的一種急性非化膿性炎癥，常伴有繼發(fā)性管腔內血栓形成，且由于供血不足，易致傷口愈合緩慢、疼痛劇烈難忍［1］。生肌玉紅膏作為活血生肌的外用藥物，具有化腐抗炎、消腫止痛的效用，并對瘡毒及愈合困難潰瘍、燒傷、燙傷等病癥有良好治療效果［2］。血管內皮祖細胞（EPC）為骨髓單個核細胞，能誘導分化為內皮細胞，在組織缺血、損傷、外源性細胞因子及藥物刺激作用下，EPC可向血管受損部位聚集并參與到血管修復和新生血管形成［3］。由于EPC缺乏特征性血管腔樣結構，僅從形態(tài)學特征上無法對其進行辨認，CD34、CD133是目前公認鑒定EPC表面分子的抗原組合［4］。血管平滑肌細胞的異常增殖是許多血管類疾病的共同病理基礎。在高血壓、動脈粥樣硬化以及血管成形術后再狹窄等多種血管性疾病中，均伴隨血管平滑肌細胞的異常增殖。2021年6月—8月，我們探究了生肌玉紅膏聯合EPC細胞對血栓性脈管炎大鼠血管平滑肌細胞凋亡及炎性因子表達的影響及機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取SPF級SD健康大44只，體質量120～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學動物學部提供，使用許可證號：SCXK（湘）2020-0075，于室溫15～25℃、每日光照12 h的室內飼養(yǎng)，濕度為45%～70%，喂養(yǎng)條件為標準飼料、自來水自由攝取，所有操作嚴格按照實驗動物倫理委員會動物管理與使用指南執(zhí)行。BS-124s型電子天平（北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司），離心機（上海醫(yī)用儀器廠），顯微鏡（重慶光學儀器廠），切片機（美國Bio-Rad公司），FACS Calibur流式細胞儀（桂林中輝科技發(fā)展有限公司），RIPA裂解液、上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測試試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（重慶天圣制藥有限公司），生肌玉紅膏（廣東達安生物基因有限公司），EPC（上海生物工程有限公司）。

1.2 分組及血栓性脈管炎模型制備根據Siegal推薦的神經功能判斷六級分法進行評分后將大鼠分為正常組、模型組、生肌玉紅膏組、EPC干預組，每組10只，除正常組外，均建立血栓性靜脈炎動物模型。對大鼠進行腹腔內注射戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下將大鼠左后肢進行脫毛處理，在腹股溝中點至膝內側行手術切除直徑為1.5 cm的皮膚組織，用止血鉗夾破壞深筋膜，夾閉阻斷血流，在鉗夾后的肌纖維內皮下滴加松節(jié)油0.1 mL，包扎后分籠飼養(yǎng)，當肢體出現缺血性改變、壞死時則視為建模成功。44只大鼠隨機選擇34只建立動物模型，術后感染死亡4只，30只大鼠建模成功。

1.3 各組給藥干預建模8 h后，正常組與模型組不進行干預，尾靜脈輸注生理鹽水1 mL，每日1次，并進行傷口包扎固定處理；EPC干預組注射數量為5×105個EPC細胞后，采用創(chuàng)面外敷生肌玉紅膏治療，每次0.2 mg/0.5 cm2，涂于創(chuàng)傷局部后按摩15 min，每日1次；生肌玉紅膏組給藥依據文獻［5］，具體組成：白芷25g，紫草10g，甘草60g，當歸100g，血竭20g，輕粉20g，麻油10g，制成膏劑后涂于創(chuàng)傷表面，每日換藥1次，均連續(xù)干預10 d。

1.4 EPC培養(yǎng)EPC用含有20%FBS的DMEM重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察，當細胞布滿培養(yǎng)皿即可傳代。傳代時用含有0.25%胰酶、1 mmol/L EDTA和酚紅的消化液，待鏡下觀察到細胞收縮、變圓，立即加入含20%FBS的DMEM終止消化，并用吸管將細胞吹打，按1∶2進行傳代。3代后可改用10%FBS的DMEM培養(yǎng)。

1.5 血清炎性因子白細胞介素（IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉化生長因子（TGF-β1）檢測采用ELISA法。抽取大鼠尾部靜脈血1.5 mL，3 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，在400 nm波長處檢測OD值，根據標準曲線和OD值計算IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1的含量。計算公式：（對照OD值-測定OD值）×271倍×［1.0 mL÷（60 s×取樣量）×樣本測試前稀釋倍數］。

1.6 組織形態(tài)觀察組織提取：運用脊椎脫臼法處死大鼠，于無菌條件下剪開皮膚組織，取頸動脈血管組織約1.5 cm，放入生理鹽水中進行剝離，采用6%多聚甲醛固定液固定，將載玻片、蓋玻片清潔后放入烤箱烘干待用，脫水，將透明后的血管組織置于已溶化的石蠟中保溫，后進行包埋，于切片機上每隔200μm切一張厚度為3μm的切片，恒溫箱中烘干，將制備好的切片進行HE染色。HE染色：將組織進行石蠟包埋，置于10%甲醛溶液中，固定過夜，沖洗，浸于15%的EDTA溶液中脫鈣，梯度脫水后石蠟包埋，4 μm切片備用，室溫15 min，二苯甲脫蠟后按照100%、90%、80%及70%乙醇進行梯度脫水，蘇木精染色15 min，1%鹽酸處理，伊紅復染，梯度乙醇脫水，封片后觀察組織形態(tài)。

1.7 CD34、CD133表達檢測采用免疫熒光法。將2%多聚甲醛固血管組織切片，進行PBS洗滌3次，5 min/次，加入5%PBS液，常溫放置30 min，去除液體后加FITC標記的CD34、CD133抗體（2 mg/mL）各2μL于濕盒薄膜上，將蓋玻片的貼壁細胞面蓋在抗體稀釋液上，避光作用2 h后用防粹滅劑中性樹脂封片，選5個高倍視野，顯微鏡（×200）下觀察，陽性細胞呈現綠色熒光和藍色熒光，計算CD34、CD133。

1.8 平滑肌細胞凋亡率測算采用TUNEL法。將血管組織脫蠟及水化后，PBS溶液沖洗3次，每次5 min，取TUNEL反應液，恒溫孵育2 h，將玻片置于PBS中在沖洗5 min×3次，浸入濃度為3%過氧化氫中10 min后用PBS溶液脫色，酶標反應后PBS洗15 min，置于DAB混合液出現淺棕色背景時采用去離子水反復沖洗3次，每次3 min，蘇木素進行復染，用濃度為1%的乙醇分化，氨水反藍后沖洗干凈，將切片依次放入濃度為70%、80%乙醇和無水乙醇各脫水10 min，脫水透明3 min，樹膠封片，顯微鏡下觀察凋亡細胞呈棕黃色，切片在高倍鏡下隨機選10個視野，計算凋亡細胞數目及凋亡率，凋亡率=凋亡細胞總數/（凋亡細胞總數＋正常細胞總數）×100%。

1.9 內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）蛋白表達檢測采用免疫印跡法。將血管組織進行胰蛋白酶消化及蛋白提取，加入SDS上樣緩沖液，變性蛋白，加樣，SDS-PAGE凝膠垂直電泳，電轉移PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗VEGF（1∶300）、bFGF（1∶500），室溫孵1 h，5℃孵育過夜，加二抗羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光顯影，以β-actin作為內參照，凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集和分析，用Quantity One-v 4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，計算VEGF、bFGF蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平比較模型組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平高于正常組（P均＜0.05），EPC干預組以上指標低于模型組（P均＜0.05），生肌玉紅膏組以上指標高于EPC干預組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EPC干預組比較，△P＜0.05。

組別正常組模型組EPC干預組生肌玉紅膏組F P n 10 10 10 10 IL-6（ng/mL）16.15±2.19 142.06±8.56*41.25±4.57*#63.28±6.34*#△851.800＜0.05 IL-8（ng/mL）9.54±1.26 48.69±4.12*19.26±2.87*#30.11±3.83*#△271.600＜0.05 TNF-α（pg/mL）16.12±3.05 45.82±11.72*25.20±5.36*#36.56±8.34*#△215.360＜0.05 TGF-β1（pg/mL）9.20±1.36 28.69±8.56*15.21±4.15*#21.37±6.49*#△98.630＜0.05

2.2 各組組織形態(tài)觀察正常組大鼠血管壁內膜完整無脫落現象，血管周圍組織未出現炎性細胞浸潤；模型組有明顯血栓形成，多數血管壁結構消失和內膜脫落，血管平滑肌細胞排列紊亂，血管周圍組織可見炎性細胞大量浸潤；EPC干預組從管腔結構和內膜脫落情況來看，組織學變化明顯緩解，極少量外周炎性細胞浸潤，血管平滑肌細胞排列趨于整齊；生肌玉紅膏組可見少量血栓和炎性細胞浸潤，并伴有部分內膜脫落，血管平滑肌細胞排列略顯紊亂。

2.3 各組大鼠血管組織中CD34、CD133表達比較模型組大鼠血管組織中CD34、CD133表達低于正常組（P均＜0.05），EPC干預組以上指標高于模型組（P均＜0.05），生肌玉紅膏組CD34、CD133表達低于EPC干預組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血管組織中CD34、CD133表達比較（%）

2.4 各組大鼠血管組織中平滑肌細胞凋亡率比較正常組、模型組、EPC干預組、生肌玉紅膏組血管組織中平滑肌細胞凋亡率分別為（3.10±0.16）%、（19.80±2.10）%、（38.60±5.63）%、（23.70±3.45）%，與正常組比較，模型組血管組織中平滑肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，EPC干預組血管組織中平滑肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與EPC干預組比較，生肌玉紅膏組平滑肌細胞凋亡率降低（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠血管組織中VEGF、bFGF蛋白表達比較模型組血管組織中VEGF、bFGF蛋白表達低于正常組（P均＜0.05），EPC干預組VEGF、bFGF蛋白表達高于模型組，生肌玉紅膏組VEGF、bFGF蛋白表達低于EPC干預組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血管組織中VEGF、bFGF蛋白表達比較

3 討論

血栓性靜脈炎中醫(yī)稱之為“惡脈”或“脈痹”，多發(fā)生于下肢或盆腔內靜脈區(qū)，臨床老年人發(fā)病率較高，其病因與外傷或術后靜脈壁損傷產生的血流滯緩增高、營血回流受阻等因素有關，最終導致患肢部位產生血滯、腫脹、疼痛等不良反應［6］。生肌玉紅膏具有利濕消炎、化痛散結、通脈等功效。郭芳等［7］研究證實，生肌玉紅膏對患處的抗炎、殺菌效果確切，對閉塞性脈管炎有良好治療效果。EPC作為一種干細胞因子，在參與炎癥反應過程中有較強的抗炎作用。

本研究結果顯示，EPC干預組中IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1表達低于模型組，提示生肌玉紅膏通過介導EPC分化對降低炎性因子表達有積極作用。在血栓性靜脈炎癥早期，由于炎癥細胞聚集釋放IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1等炎癥因子，使炎癥信號進一步放大導致炎性反應過度，促進血栓形成，降低炎癥因子產生是治療血栓性靜脈炎的關鍵［8-9］。生肌玉紅膏中的甘草、血竭等成分具有抗炎、清除氧自由基、增強免疫功能等作用。生肌玉紅膏中的血竭和當歸成分具有祛瘀消腫、活血通絡之功效，而紫草具有清熱涼血之功效，聯用可發(fā)揮祛腐解毒、活血散瘀及生肌斂瘡的效用。楊輝等［10］研究顯示，生肌玉紅膏在促進創(chuàng)面損傷修復及抗炎方面效果更佳，可抑制IL-6、TNF-α和IL-8等炎性因子表達，促進乳腺癌患者創(chuàng)面恢復。本研究結果與之相似，推測生肌玉紅膏可能通過抑制炎癥因子活性延緩血栓性靜脈炎進展。

EPC作為一類能參與循環(huán)增殖并能分化為血管內皮細胞的干細胞，與早期造血干細胞及內皮細胞有相同前體。研究顯示，CD34+EPC構成了內皮細胞的循環(huán)池，可在內皮細胞脫落或損傷時對受損血管進行修復，CD34、CD133的靈活變化反映了細胞活性，且血管內皮的自我修復能力隨CD34、EPC降低而下降，代表血管內皮的修復能力變差，繼而可能伴隨血管病變、急性心腦血管以及靶器官損害等現象產生［11］。董智慧等［12］研究顯示，當動脈血管出現直徑變小或閉塞情況時會對肢體內血液循環(huán)造成影響，導致血栓性靜脈炎中CD34、CD133表達降低。本研究中EPC干預組中的CD34、CD133表達高于模型組，提示生肌玉紅膏可能通過提高CD34、CD133表達改善血栓性脈管炎大鼠的內皮功能。生肌玉紅膏中的當歸、紫草、白芷等，可明顯促進瘡瘍愈合，全方共奏活血解毒、潤膚生肌之功效。研究顯示，生肌玉紅膏對改善糖尿病足損傷引起的血管平滑肌強烈收縮和肢體血管持續(xù)痙攣導致的肢體缺血及血管內皮功能有良好修復作用［5］。由此推測，生肌玉紅膏可能通過介導CD34、CD133參與內皮組織循環(huán)、增殖，參與生理性血管形成，減輕血管內皮炎性因子反應，進而在病理狀態(tài)下增強代償性血管重建能力和增強受損血管的修復能力，進而防止血栓性靜脈炎的發(fā)生。

血栓性靜脈炎的發(fā)生是平滑肌細胞增殖、凋亡、血管重構、血管炎癥等多種復雜病理及生理過程。本研究中，EPC干預組的平滑肌細胞凋亡率高于模型組，提示生肌玉紅膏可能通過介導EPC促進平滑肌細胞的凋亡。血栓性靜脈炎的形成以平滑肌肌動蛋白的降低和細胞外基質膠原的過度沉積為特征，生肌玉紅膏具有增強創(chuàng)面抗氧化機制，改善纖維功能，使毛細血管開放并增強血管通透性，增加平滑肌細胞的凋亡，降低病灶部位炎性反應，促進血栓性靜脈炎的恢復［13］。

VEGF與bFGF具有促進創(chuàng)面愈合及血管再生、外周神經纖維再生和增強創(chuàng)面組織修復作用［13］。本研究中模型組血管組織中VEGF、bFGF蛋白表達低于正常組，EPC干預組的VEGF、bFGF蛋白表達高于模型組，生肌玉紅膏組VEGF、bFGF蛋白表達低于EPC干預組，提示生肌玉紅膏與EPC可能對VEGF、bFGF蛋白表達有一定影響。研究顯示，血栓性靜脈炎中的血管內噬細胞和內皮細胞分泌的VEGF、bFGF較低，而血管內通透性大的不完整基膜和容易破裂出血的新生毛細血管受到刺激后，血漿滲入血腫腔中，導致血栓性靜脈炎創(chuàng)面不斷增大［14］。生肌玉紅膏中的甘草、白蠟等成分具有瀉火解毒、助生新肌、調和諸藥等功效，通過提高創(chuàng)面肉芽血紅蛋白水平與羥脯氨酸含量，促進創(chuàng)面成纖維細胞生長和膠原合成的增加，進而加速受創(chuàng)皮膚的再生。陳盛業(yè)等［15］研究顯示，生肌玉紅膏可通過刺激血管內皮細胞增殖，使VEGF與bFGF在協同作用下對血管外膜產生刺激，加速細胞間物質代謝，通過增加bFGF促進創(chuàng)面膠原合成及上皮生長進而改善新生毛細血管和創(chuàng)面微循環(huán)狀態(tài)，使創(chuàng)面愈合速度加快，降低血管內血栓形成及發(fā)展。本研究結果與之類似。

綜上所述，生肌玉紅膏可促進血栓性脈管炎大鼠的平滑肌細胞凋亡，降低炎性因子表達，激活VEGF與bFGF蛋白表達，發(fā)揮血管保護作用；其機制可能與介導EPC分化相關。