何建萍，呂夢(mèng)欣，秦茂華，蘇 虹，錢 源，陳仕平，楊 依，程 樂，唐 健

（1.昆明市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科, 昆明 650031；2.深圳華大臨床檢驗(yàn)中心, 廣東深圳 518083；3.云南華大基因研究院, 昆明 650106）

珠蛋白生成障礙性貧血（thalassemia）是基因缺陷導(dǎo)致身體無法合成足量的血紅蛋白而引起貧血的一種疾病，臨床上主要分為輕型、中間型和重型貧血[1-3]，其中重型貧血除骨髓移植外尚無有效的治療措施，需終身護(hù)理與治療，給患者家庭及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，而預(yù)防重型貧血患兒出生是最為有效的措施[4-5]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS）因自動(dòng)化程度高、通量高、成本低及具備檢測(cè)新發(fā)變異及復(fù)雜變異等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)[7]。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)首次對(duì)昆明地區(qū)人群進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因（α+β）301型篩查，對(duì)昆明地區(qū)人群攜帶率情況進(jìn)行分析，為昆明地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血防控工作提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 對(duì)2018年昆明市政府“十大惠民項(xiàng)目”中來自25家醫(yī)療機(jī)構(gòu)婚前、孕前優(yōu)生及健康體檢的5 787例樣本，進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)。所有檢測(cè)者均充分知情，本研究通過我院倫理委員會(huì)審批。

1.2 儀器與試劑 高通量測(cè)序技術(shù)：基因擴(kuò)增儀、MGISEQ-2000高通量測(cè)序儀。試劑：DNA提取試劑和擴(kuò)增試劑由廣州美基生物和深圳華大臨床檢驗(yàn)中心提供。操作嚴(yán)格按儀器設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作程序以及試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 方法 采集受檢者外周血2～3ml，EDTA-K2抗凝，采用磁珠法提取外周血樣本中基因組DNA，進(jìn)行目的DNA基因擴(kuò)增，高通量測(cè)序后，采用 生 物 信 息 分 析 軟 件Gene detection software for Thalassemia V1.0對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因（α+β）301型生信分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果 在5 787例樣本中共檢出465例攜帶者，陽性率為8.04%。其中α-檢出285例，構(gòu)成比61.29%；β-檢出131例，構(gòu)成比28.17%；復(fù)合型檢出10例，構(gòu)成比2.15%；異常血紅蛋白變異類型檢出17例，構(gòu)成比3.66%；其他變異型檢出22例，構(gòu)成比4.73%。

2.2 α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)結(jié)果 285例α-變異中，共檢出13種基因變異類型，包括6種缺失型和7種非缺失型，其中以-α3.7/αα基因型最為常見，為152例（53.33%），-SEA/αα檢出87例（30.53%），-α4.2/αα檢出23例（8.07%），Hb Westmead雜 合 子 檢 出12例（4.21%），Hb Constant Spring雜合子檢出3例（1.05%）；-α3.7/-α3.7，--THAI/αα，-α3.7/--SEA，Hb Phnom Penh雜合子、Hb Quong Sze雜合子、Initiation codon(-T)雜合子、Initiation codon(T＞C)雜合子和IVS I-1 AGGT＞AGAT donor雜合子各檢出1例，各占0.35%。

2.3 β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)結(jié)果 131例β-變異中，共檢出13種基因變異類型。Hb E雜合子、Codon 17(A＞T)雜合子各檢出35例，各占26.72%；Codon 41/42(-TTCT)雜 合 子 檢 出22例（16.79%）；IVS-II-654(C＞T)雜 合 子 檢 出20例（15.27%）；-50(G＞A)雜 合 子 檢 出6例（4.58%）；-28(A＞G)雜合子檢出4例（3.05%）；Codon 41(-C)雜合子、Codon 71/72(+A)雜合子各檢出2例，各占1.53%；-72(T＞A)雜合子、-88(C＞T)雜合子、Codon 5(-CT)CCT(Pro)＞C雜合子、Initiation codon ATG＞ACG雜 合 子 各 檢 出1例，各占0.76%；Chinese Gamma(A gamma delta beta)缺失雜合子檢出1例（0.76%）。以Hb E雜合子和Codon 17(A＞T)雜合子基因型最為常見。

2.4 復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)結(jié)果 10例復(fù)合型變異基因型中，檢出7種基因變異類型。其中-α4.2/αα并發(fā)Hb Q-Thailand雜合子檢出3例（30%）；--SEA/αα并 發(fā)Hb Hekinan II雜 合 子檢出2例（20%）；-α3.7/αα并發(fā)Init CD ATG＞-TG雜 合 子、--SEA/αα并 發(fā)Codon 41/42(-TTCT)雜合子、--SEA/αα并發(fā)Hb E雜合子、-α3.7/αα并 發(fā)Hb E雜 合 子、-α4.2/αα并 發(fā)Codon 41/42(-TTCT)雜合子各檢出1例，各占10%。

2.5 異常血紅蛋白變異基因檢測(cè)結(jié)果 17例異常血紅蛋白攜帶者中，檢出14種基因變異類型。Hb G-Taipei雜合子、Hb Hamilton雜合子、Hb J-Bangkok雜合子各檢出2例，各占11.76%；Hb Broomhill雜合子、Hb Fuchu-I雜合子、Hb G-Honolulu雜合子、Hb Groene Hart雜 合 子、Hb J-Lome雜 合 子、Hb Melusine雜合子、Hb Olivet雜合子、Hb San Bruno雜 合 子、Hb Shizuoka雜 合 子、Hb Singapore雜 合子、Hb Zurich-Albisrieden雜合子各檢出1例，各占5.88%。

2.6 其他變異類型基因檢測(cè)結(jié)果 22例其他變異基因型中，檢出14種基因變異類型。HBA2:c.46G＞A(Gly＞Ser)雜合子檢出5例（22.73%）；HBB:c.*+129T＞A雜合子檢出4例（18.18%）；HBB:c.-107A＞C雜合子檢出2例（9.09%）；HBA1:c.*+41delC雜合子、HBA1:c.16G＞A(Ala＞Thr)雜合子、HBA1:c.203C＞T(Thr＞Ile)雜 合 子、HBA1:c.300G＞C(Lys＞Asn)雜合子、HBB:c.-132G＞A雜合子、HBB:c.*+132C＞T雜合子、HBB:c.-146G＞T雜合子、HBB:c.-180G＞C雜 合 子、HBB:c.-71G＞T雜 合 子、HBB:c.-39T＞G雜合子各檢出1例（4.55%）；HBA2:c.95+5_HBA2:c.95+28delGGCTCCCTCCCCTGCTC CGACCCG純合子檢出1例（4.55%）。根據(jù)人類血紅蛋白變異數(shù)據(jù)庫(HbVar)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)查詢可知這14種基因變異類型均無明顯致病性。

3 討論

珠蛋白生成障礙性貧血主要分布于地中海沿岸、東南亞、熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國主要集中于南方省份，其中云南省為高發(fā)地區(qū)之一[7-9]。在珠蛋白生成障礙性貧血防控方面，云南省前期主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、反向斑點(diǎn)雜交法(reverse dot blot，RDB)等傳統(tǒng)技術(shù)[10]對(duì)昆明地區(qū)妊娠期婦女、新生兒進(jìn)行檢測(cè)。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）已成為用于珠蛋白生成障礙性貧血全面防控的新檢測(cè)手段[4]。本研究采用NGS對(duì)昆明地區(qū)人群進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因（α+β）301型進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽性率為8.04%，高于前期報(bào)道的妊娠期婦女檢出率5.92%[11]和新生兒珠蛋白生成障礙性貧血檢出率7.75%[12]，推測(cè)與前期使用檢測(cè)方法的局限性有關(guān)。

本研究α-珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型以-α3.7/αα基因型最為常見，β-珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型以Hb E雜合子、CD17(A＞G)雜合子基因型占比最高，同昆明地區(qū)妊娠婦女、新生兒檢出的α-及β-基因變異類型報(bào)道的基因變異類型排序一致[11-12]，表明昆明地區(qū)人群α-基因類型最常見的為-α3.7/αα，該基因型的檢出對(duì)防控工作起著積極作用；β-基因變異類型頻次最高的Hb E雜合子與CD17(A＞G)雜合子，數(shù)據(jù)顯示昆明地區(qū)與我國南方其他地區(qū)β-基因型突變常見類型有所不同[2,13]。通過NGS檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)昆明地區(qū)人群中異常血紅蛋白變異類型、復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血變異類型以及其他變異類型均有檢出，提示昆明地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型較為復(fù)雜，可能與昆明地區(qū)地理、氣候、少數(shù)民族等影響因素的共同作用有關(guān)[14]。

本研究首次采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)后，珠蛋白生成障礙性貧血的陽性率明顯高于前期報(bào)道的陽性率，提示昆明地區(qū)存在稀有、罕見變異珠蛋白生成障礙性貧血基因，因此，在昆明地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血防控工作方面，除了以常見珠蛋白生成障礙性貧血防控為主，同時(shí)也要兼顧稀有、罕見變異珠蛋白生成障礙性貧血，以免造成漏診。昆明地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型較為復(fù)雜，NGS可以更全面檢測(cè)到罕見、稀有的珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型，采用NGS技術(shù)作為珠蛋白生成障礙性貧血高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)篩查手段，對(duì)豐富珠蛋白生成障礙性貧血基因譜具有重要的應(yīng)用價(jià)值。