趙希娟，龐雯輝，譚濤，張耀海，焦必寧*

1(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑橘類果品質(zhì)量安全控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(西南大學(xué))，重慶，400715)2(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)3(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)

檸檬果實具有良好的營養(yǎng)、保健和藥用價值，這主要由于其富含類黃酮、香豆素、類檸檬苦素和酚酸等生物活性成分[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬果實中生物活性成分的種類和含量受品種和生長環(huán)境等多種因素影響[3-4]。目前對檸檬中生物活性物質(zhì)檢測方法的研究已有報道。高煒等[5]采用分光光度計法評價了尤力克黃檸檬、小青檸、青檸檬和香水檸檬的果皮與果肉中總酚含量，并用超高效液相色譜對其中的酚酸和類黃酮進(jìn)行定性和定量。KAWAII等[6]利用HPLC技術(shù)研究了在相同產(chǎn)地和年份生長的66種柑橘及近緣屬樣品中24種類黃酮，在甜檸檬和尤力克檸檬可食部位的類黃酮化合物含量比較分析中發(fā)現(xiàn)橙皮苷的含量最高，該實驗使用了55 min的梯度洗脫程序。VAIO等[7]發(fā)現(xiàn)西西里和坎帕尼亞的18種檸檬果皮乙醇提取物的精油含量和抗氧化活性沒有明顯的相關(guān)性，可能是由于乙醇提取物中含有其他的植物化學(xué)物質(zhì)如香豆素、呋喃香豆素和酚類物質(zhì)。BARRECA等[8]使用反相液相色譜聯(lián)用紫外和質(zhì)譜技術(shù)研究了地中海甜檸檬的檸檬汁中類黃酮組成，共檢測到8種類黃酮。PETERSON等[9]曾綜述了葡萄柚、檸檬和酸橙中的黃烷酮，其中檸檬中占主導(dǎo)地位的黃烷酮是橙皮苷。GIRONéS-VILAPLANA等[10]使用高效液相色譜聯(lián)用紫外和質(zhì)譜檢測技術(shù)定量分析了“Fino”檸檬汁中17種類黃酮和4種羥基肉桂酸類化合物的含量。以上研究并未涉及檸檬果實中香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)以及類檸檬苦素的分析檢測。JUNGEN等[11]基于高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合紫外檢測對檸檬黃皮層、白皮層和內(nèi)果皮中的11種香豆素類和補(bǔ)骨脂素類物質(zhì)進(jìn)行了鑒定與定量分析，黃皮層中的物質(zhì)含量明顯高于白皮層和內(nèi)果皮。涂勛良等[12]建立了可在20 min內(nèi)完成檸檬苦素和諾米林含量同時測定的HPLC方法，并據(jù)此對不同產(chǎn)地和不同品種檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林含量進(jìn)行了測定。本課題組基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-HRMS)優(yōu)化出一種定性定量分析柑橘種子中檸檬苦素、諾米林和奧巴叩酮3種類檸檬苦素物質(zhì)的方法[13]。

目前，針對檸檬中生物活性成分的定量研究多見于高效液相色譜與超高效液相色譜，基于質(zhì)譜的檢測方法較少，且所測成分相對單一或者分析檢測周期偏長。為了進(jìn)一步有效研究檸檬中的生物活性成分，本研究基于UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下結(jié)合所有理論碎片離子的連續(xù)窗口采集(sequential window acquisition of all theoretical fragment ions，SWATH)，同時對檸檬中多類型生物活性成分進(jìn)行篩查定量研究，儀器的高分辨率可提高篩查鑒定能力。SWATH是一種全景式、高通量和數(shù)據(jù)可追溯的質(zhì)譜技術(shù)，可對樣品中所有可檢測到的化合物進(jìn)行全面檢測和定量分析，它在極低濃度下也能采集并提供類質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測的定量信息，即二級定量信息，并具有強(qiáng)大的解卷積功能，可抗一級干擾，得到準(zhǔn)確的二級質(zhì)譜信息。王夢穎等[14]基于UPLC-Q-TOF-HRMS結(jié)合SWATH采集方法對乳液類化妝品中的9種抗過敏違禁藥物進(jìn)行了篩查與定量研究，實驗分別利用了一級母離子和二級子離子的方式來進(jìn)行定量，并考察了這2種定量方式對基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果表明，采用SWATH二級特征子離子的方式進(jìn)行定量可以使基質(zhì)效應(yīng)下降，同時定量的準(zhǔn)確性也有所提高。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確的篩查定量方法，對檸檬中的26種化合物包括13種類黃酮，8種香豆素和呋喃香豆素，2種類檸檬苦素和3種酚酸的含量進(jìn)行檢測分析。這對于進(jìn)一步評估檸檬的營養(yǎng)、品質(zhì)以及開發(fā)功能性檸檬產(chǎn)品具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用檸檬材料于2019年11月采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家果樹種質(zhì)資源(重慶)柑橘圃，品種名稱(資源圃編號)依次為：扁紅檸檬(LM0149)、里斯本檸檬(LM0004)、柯爾提粗檸檬(LM0094)、美國粗檸檬(LM0062)、尤力克檸檬(LM0084)、北京檸檬(LM0126)。在3棵長勢一致果樹上的不同方位(上、中、下、內(nèi)、外部)均勻地采摘20～30個處于成熟期的檸檬果實。

1.2 試劑

甲酸為色譜純，上海吉至生化科技有限公司；Milli-Q Advantage A10 超純水器，美國Millpore公司；標(biāo)準(zhǔn)品：新西蘭牡荊苷、5-降甲基蜜桔黃素、地奧司明、梔子黃素B、檸檬苦素、檸檬油素、諾米林(純度均 98.0%)、8-牻牛兒醇基補(bǔ)骨脂素(純度98.5%)、傘形花內(nèi)酯(純度99.0%)，成都克洛瑪生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品：水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、蛇床子素、4′,5,7,8-四甲氧基黃酮、水仙苷、異橙皮內(nèi)酯(純度均98.0%)、4′,5,6,7-四甲氧基黃酮(純度95.0%)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，橙皮油內(nèi)酯(純度98.5%)，美國Sigma-Aldrich公司；蘆丁(純度99.5%)、甜橙黃酮(純度98.0%)、川陳皮素(純度99.71%)、桔皮素(純度98.49%)、蕓香柚皮苷(純度99.38%)、橙皮苷(純度97.06%)、對羥基苯甲酸(純度99.9%)、對香豆酸(純度99.84%)、阿魏酸(純度99.95%)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 儀器

Nexera X2型UPLC，日本島津公司；X500R型QTOF，美國AB SCIEX公司；KQ5200DE超聲波清洗儀, 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；3K15高速冷凍離心機(jī)，德國SIGMA公司；PB3002-S/FACT分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液A，取1 mL A溶液用甲醇稀釋得質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液B。分別準(zhǔn)確移取A溶液0、25、50、250、500、1 000 μL，B混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5、10、25、50、100、1 000 μL，用甲醇分別稀釋得質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。

1.5 UPLC-Q-TOF/HRMS條件

1.5.1 色譜條件

UPLC所用色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm), 柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B乙腈，流速0.3 mL/min，正負(fù)離子模式下的梯度洗脫程序與龐雯輝等[15]的方法一致。

1.5.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜數(shù)據(jù)是在AB SCIEX的X500R QTOF系統(tǒng)上采用SWATH模式在正、負(fù)2種離子模式下采集的。正負(fù)離子模式下的參數(shù)參照龐雯輝等[15]的研究。

1.6 方法學(xué)驗證

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

在檸檬樣品上機(jī)檢測前，將預(yù)先配制的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液上機(jī)檢測，通過對每種化合物5種以上的適當(dāng)濃度下的特征二級子離子碎片峰面積進(jìn)行線性回歸，擬合所有目標(biāo)化合物的線性曲線。根據(jù)定量限來評估所提出方法的靈敏度，其由信噪比為10∶1時的濃度確定。

1.6.2 加標(biāo)回收率試驗

獲得第二屆“十杰”稱號及提名獎作者的平均年齡是34歲，這一屆“十杰”，出自國營照相館的攝影師不到一半。相較于第一屆，照相業(yè)圈外的人充實了人像攝影隊伍，帶來了清新的作品。參賽者中的許多人受過高等教育或美術(shù)專業(yè)訓(xùn)練，思路開闊，善于從其它藝術(shù)中吸收營養(yǎng)。

為了確定目標(biāo)化合物的回收率，將適當(dāng)濃度的26種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加到檸檬樣品的提取物中。首先確定混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加到檸檬樣品之前和之后的每種目標(biāo)化合物的濃度，進(jìn)行濃度差值的計算，再將濃度差值與已知的混合標(biāo)準(zhǔn)液添加量進(jìn)行比較，從而可以確定目標(biāo)化合物的回收率。每種目標(biāo)化合物均進(jìn)行3次重復(fù)試驗，加標(biāo)回收率以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

1.6.3 精密度試驗

在1 d中3個不同的時間段對校準(zhǔn)樣品進(jìn)行了3份重復(fù)檢測，以考察日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d在同一時間段測定校準(zhǔn)樣品中的目標(biāo)化合物，以考察日間精密度。日內(nèi)和日間精密度均以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SCIEX OS軟件控制UPLC-Q-TOF系統(tǒng)采集實驗數(shù)據(jù)，并對目標(biāo)化合物進(jìn)行篩查匹配，對二級子離子定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，目標(biāo)化合物二級定量子離子信息詳見表1。采用Origin 2019b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖；所有樣品均進(jìn)行3次生物重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示測定結(jié)果。

表1 26種目標(biāo)化合物的液相和質(zhì)譜信息Table 1 The LC-MS information of 26 target compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜方法優(yōu)化

可變窗口是SWATH質(zhì)譜方法所特有的一種采集技術(shù)，其可根據(jù)化合物母離子的質(zhì)量范圍來調(diào)整不同采集窗口的范圍大小，以便在分析樣品中母離子質(zhì)荷比密度最高的區(qū)域(預(yù)期有最大數(shù)量的化合物和分析物的區(qū)域)采用更小的母離子質(zhì)荷比范圍的采集窗口，從而降低漏掉復(fù)雜樣品中低豐度峰的風(fēng)險，提高檢測的專一性[16-17]。在本實驗中，首先分別取經(jīng)過前處理的6種檸檬果皮原液200 μL于2 mL進(jìn)樣小瓶中，混勻后上機(jī)進(jìn)行檢測，得到所檢測樣品的總離子流圖信息，對在正(10 min內(nèi))、負(fù)離子(6 min內(nèi))模式下檢測到的所有化合物分別按照質(zhì)荷比的大小進(jìn)行排序，最后通過軟件去卷積技術(shù)依據(jù)化合物質(zhì)荷比與峰面積分別對其進(jìn)行連續(xù)平均分段，以該分段數(shù)據(jù)設(shè)置為SWATH掃描窗口。在本實驗條件下，正離子模式下化合物的數(shù)量多于負(fù)離子模式，因此正離子模式設(shè)置15個掃描窗口，分別為：[99.5-141.5]、[140.5-149.5]、[148.5-191.5]、[190.5-207.5]、[206.5-255.5]、[254.5-274.5]、[273.5-287.5]、[286.5-329.5]、[328.5-371.5]、[370.5-374.5]、[373.5-403.5]、[402.5-404.5]、[403.5-434.5]、[433.5-566.5]、[565.5-800.5]；負(fù)離子模式下設(shè)置10個掃描窗口，分別為：[99.5-191.5], [190.5-249.5], [248.5-325.5]、[324.5-373.5]、[372.5-457.5]、[456.5-531.5]、[530.5-580.5]、[579.5-609.5]、[608.5-611.5]、[610.5-800.5]。

2.2 方法學(xué)驗證

表2顯示了相關(guān)系數(shù)均高于0.99的26種目標(biāo)化合物的線性方程、線性范圍，且每種目標(biāo)化合物的線性曲線范圍均有5個及以上的濃度數(shù)量值，因此在本試驗方法下，26種目標(biāo)化合物均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。所有目標(biāo)化合物的定量限不完全相同，其中有5種目標(biāo)化合物定量限低至0.001 μg/L，具有較高的靈敏度。從表2可知，所有目標(biāo)化合物的回收率均在(84.27±3.02)%～(114.25±1.77)%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。所有目標(biāo)化合物的日內(nèi)RSD不超過6.39%，日間RSD值不超過5.33%，均在可接受范圍之內(nèi)。以上結(jié)果表明，該方法具有良好的線性關(guān)系、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度，可用于實際樣品中類黃酮、香豆素和呋喃香豆素、類檸檬苦素和酚酸多類型生物活性成分的定量檢測分析。

表2 方法的驗證參數(shù)(n=3)Table 2 Validation parameters of the method(n=3)

2.3 檸檬中生物活性成分的定量分析

經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法可用于類黃酮、香豆素和呋喃香豆素、類檸檬苦素和酚酸等多類型生物活性成分的定量分析。因此，本實驗基于該方法對6種檸檬(扁紅檸檬、里斯本檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、尤力克檸檬和北京檸檬)的果皮、果肉和果汁進(jìn)行了定量檢測分析，結(jié)果均以鮮重計。

6種檸檬樣品不同部位中13種類黃酮的含量如圖1所示，檸檬果實不同部位的類黃酮主要成分相差不大，但含量差異較大，檸檬果皮所含類黃酮含量顯著高于果肉和果汁，果肉中類黃酮總量位居第2，果汁中的含量最低。從檸檬品種來看，除了扁紅檸檬，其他5種檸檬的果皮、果肉和果汁中均是橙皮苷的含量最高。扁紅檸檬果皮中，川陳皮素(323.65±4.60) μg/g、桔皮素(213.50±11.46) μg/g和蕓香柚皮苷(206.55±8.84) μg/g的含量占主導(dǎo)地位，橙皮苷的含量排第4(104.22±8.04) μg/g。而扁紅檸檬果肉和果汁中均為蕓香柚皮苷含量最豐富，新西蘭牡荊苷次之，橙皮苷位居第3。對于另一種外果皮呈紅色的柯爾提粗檸檬來說，川陳皮素(429.05±3.46) μg/g、桔皮素(135.75±0.78) μg/g和5-降甲基蜜桔黃素(68.90±9.73) μg/g等多甲氧基黃酮的含量也很豐富。里斯本檸檬、尤力克檸檬和北京檸檬果皮中新西蘭牡荊苷是僅次于橙皮苷，是含量位居第2的類黃酮。同時，在美國粗檸檬果皮中新西蘭牡荊苷的含量(41.83±7.62) μg/g低于川陳皮素(70.14±10.49) μg/g的含量，位居第3?？傮w來看，扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬和美國粗檸檬的果皮相比其他3種檸檬來說，多甲氧基黃酮的含量較為豐富，其中川陳皮素是含量最高的多甲氧基黃酮。

a-果皮；b-果肉；c-果汁圖1 六種檸檬的果皮、果肉和果汁中類黃酮的含量Fig.1 Contents of flavonoids in the peel, pulp and juice of six lemon fruits

2.3.2 檸檬中香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)的含量分析

由圖2可知，果皮中香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)的含量普遍高于果肉，果汁中含量最少。不同品種檸檬各部位香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)的含量也有差異。果皮中，除了扁紅檸檬和美國粗檸檬，其他4種檸檬中含量最高的均為檸檬油素，其中柯爾提粗檸檬果皮中的檸檬油素含量高達(dá)(385.30±3.39) μg/g。扁紅檸檬果皮中橙皮油內(nèi)酯的含量最高為101.89 μg/g，傘形花內(nèi)酯次之(89.62 μg/g)；美國粗檸檬中白當(dāng)歸素的含量最高，為(1.28±0.22) μg/g，檸檬油素次之(0.74±0.13) μg/g。檸檬果肉中，扁紅檸檬中橙皮油內(nèi)酯含量最高，為(1.08±0.64) μg/g，傘形花內(nèi)酯次之(0.96±0.69) μg/g；柯爾提粗檸檬(1.98±0.13) μg/g、美國粗檸檬(1.31±0.12) μg/g、尤力克檸檬(5.13±0.83) μg/g和北京檸檬(0.54±0.12) μg/g中檸檬油素的含量最高，蛇床子素的含量最低；而里斯本檸檬果肉中檸檬油素的含量位居第2，僅次于含量最高的水合氧化前胡內(nèi)酯，二者沒有顯著差異。對果汁而言，除了扁紅檸檬中傘形花內(nèi)酯的含量最高，橙皮油內(nèi)酯次之，其他5種檸檬中檸檬油素的濃度明顯高于其他香豆素類物質(zhì)?？傮w來看，檸檬果實中檸檬油素的含量在所測香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)中含量占比較高，而蛇床子素的含量最低。

a-果皮；b-果肉；c-果汁圖2 六種檸檬果皮、果肉和果汁中香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)的含量Fig.2 Contents of coumarins and furocoumarins in the peel, pulp and juice of six lemon fruits

2.3.3 檸檬中類檸檬苦素和酚酸類物質(zhì)的含量分析

類檸檬苦素是造成柑橘苦味的主要來源之一，且大多以檸檬苦素和諾米林存在于柑橘果實中，本實驗分析了6種檸檬果皮、果肉與果汁中檸檬苦素和諾米林的含量(表3)。結(jié)果表明，6種檸檬果汁中檸檬苦素和諾米林的含量均顯著低于果皮和果肉，其中諾米林在扁紅檸檬果汁中可檢出，但因濃度低于定量限而無法準(zhǔn)確定量，且檸檬苦素在扁紅檸檬果汁中的含量也是最低，為 0.43 μg/g。檸檬苦素和諾米林在里斯本檸檬果皮中的含量均為最高，分別為166.85、199.20 μg/g，尤力克檸檬果皮次之，分別為166.75、193.60 μg/g。扁紅檸檬、里斯本檸檬、美國粗檸檬和尤力克檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林的含量以及柯爾提粗檸檬果皮的諾米林均大于其對應(yīng)果肉中的含量，而北京檸檬果皮中的檸檬苦素和諾米林的含量均低于果肉，柯爾提粗檸檬果皮(115.85 μg/g)中檸檬苦素的含量略低于果肉(129.80 μg/g)。整體來看，檸檬果皮中類檸檬苦素的總含量大于果肉。

表3 檸檬果實中類檸檬苦素和酚酸類物質(zhì)的含量 單位：μg/g

從表3可知，對羥基苯甲酸、對香豆酸和阿魏酸在6種檸檬果皮均可檢出并能準(zhǔn)確定量，阿魏酸的含量顯著高于對羥基苯甲酸和對香豆酸。其中，阿魏酸在扁紅檸檬果皮中的含量最高為4.13 μg/g，柯爾提粗檸檬次之，美國粗檸檬含量最低。對羥基苯甲酸在扁紅檸檬、里斯本檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬和尤力克檸檬果皮中的含量均高于對香豆酸，其在里斯本檸檬果皮中含量最高；而北京檸檬果皮中對羥基苯甲酸的含量略低于對香豆酸，但差異不顯著。對羥基苯甲酸在6種檸檬果肉、柯爾提粗檸檬和北京檸檬的果汁中，阿魏酸在扁紅檸檬的果肉中均有檢出，但因其濃度低于定量限，故無法準(zhǔn)確定量。

2.4 檸檬果實中4類生物活性成分的代謝輪廓及總體評價

由以上實驗數(shù)據(jù)分析可知，檸檬果皮中所測生物活性物質(zhì)的種類和含量均多于果肉和果汁。圖3-a再次印證了該結(jié)果，檸檬果實中類黃酮、酚酸、類檸檬苦素和香豆素類物質(zhì)的積累模式具有組織特異性，不同組織部位的種類和含量差異較大，以果皮中最豐富，果肉次之。由圖3-b可知，6個檸檬品種中類黃酮、類檸檬苦素、酚酸和香豆素等26種物質(zhì)的代謝具有多樣性，其中里斯本檸檬和尤力克檸檬的代謝積累模式相近，而扁紅檸檬與其他5種檸檬的生物活性成分代謝積累模式差異較大。同時，除扁紅檸檬之外，其他5個品種都是橙皮苷的含量最高，扁紅檸檬中則以川陳皮素和桔皮素等多甲氧基黃酮的含量居高，與圖1結(jié)果一致。

a-不同部位；b-不同品種圖3 各種化合物在檸檬的不同部位和不同品種中的積累規(guī)律Fig.3 Accumulation patterns of the compounds in different tissues and varieties of lemon

本研究中尤力克檸檬果皮和果汁的主要類黃酮為橙皮苷、新西蘭牡荊苷和地奧司明，與于玉涵等[18]研究結(jié)果中橙皮苷、圣草枸櫞苷、地奧司明和蘆丁為尤力克檸檬果皮和果汁中主要類黃酮略有不同。原因可能是提取與檢測方法的差異以及尤力克檸檬產(chǎn)地不同。CARISTI等[19]測定了西西里的檸檬品種果汁中3種類黃酮的含量，其中“Femminello commune”和“Interdonato”2個品種的果汁中橙皮苷的含量最高，圣草枸櫞苷次之，地奧司明第3。BARRECA等[8]研究發(fā)現(xiàn)地中海甜檸檬的檸檬汁所含的8種類黃酮中橙皮苷含量最高，為4.29 mg/L。GIRONéS-VILAPLANA等[10]對“Fino”檸檬汁中類黃酮和羥基肉桂酸類化合物含量的分析中，橙皮苷的含量最高，與本研究結(jié)果一致。曾凡坤等[20]曾對鄧肯葡萄柚、琯溪蜜柚和大紅袍紅桔等多種柑桔果皮、果汁和種子進(jìn)行類檸檬苦素的定量檢測分析，結(jié)果表明類檸檬苦素在種子中含量最高，果皮次之，果汁中的含量最低，這與本文研究結(jié)果基本一致，均為果皮中的類檸檬苦素含量大于果汁。ZHANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，中國野生柑橘果實中的酚酸主要以肉桂酸型為主，阿魏酸和對香豆酸均為肉桂酸型酚酸，其中阿魏酸是含量最豐富的酚酸。張靜等[22]對9種晚熟柑橘的果皮、果肉和果汁中的7種酚酸進(jìn)行定量分析時發(fā)現(xiàn)，阿魏酸含量顯著高于其他6種酚酸，本研究發(fā)現(xiàn)檸檬果皮中阿魏酸的含量顯著高于對香豆酸和對羥基苯甲酸，是所測3種酚酸中占主導(dǎo)地位的酚酸。

與其他柑橘類果實相比[23-25]，目前檸檬果實香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)的研究鮮有報道。本研究對6種檸檬果皮、果肉和果汁中8種香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)含量進(jìn)行了較系統(tǒng)的分析鑒定與比較。不同檸檬品種、不同部位香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)的含量均有不同程度的差異。果皮中的含量普遍高于果肉，果汁中含量最低?？傮w來看，檸檬油素、橙皮油內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯是檸檬果實中含量較高的香豆素類物質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗利用UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)對6種檸檬果實不同部位(果皮、果肉和果汁)中的13種類黃酮、8種香豆素、2種類檸檬苦素和3種酚酸進(jìn)行定量，建立了一種快速、靈敏測定檸檬中多類型生物活性成分含量的方法，該方法采用SWATH質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式結(jié)合特征二級碎片子離子峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量，可降低基質(zhì)效應(yīng)，并保證了篩查定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法學(xué)考察結(jié)果顯示該方法具有良好的線性關(guān)系、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度：線性方程的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上；定量限最低可達(dá)0.001 μg/L；日內(nèi)RSD不超過6.39%，日間RSD值不超過5.33%；加標(biāo)回收率為(84.27±3.02)%～(114.25±1.77)%。定量結(jié)果表明，不同部位與不同品種的檸檬樣品中26種生物活性成分的含量存在較大差異，檸檬果皮中生物活性成分的含量顯著高于果肉和果汁。26種生物活性成分在6種檸檬樣品中的含量排序為：柯爾提粗檸檬>里斯本檸檬>尤力克檸檬>美國粗檸檬>扁紅檸檬>北京檸檬，其中類黃酮和香豆素在柯爾提粗檸檬中的含量最高，類檸檬苦素含量在里斯本檸檬中最高，酚酸含量在尤力克檸檬最高。對多類型生物活性成分而言，類黃酮的含量在26種生物活性成分中占比最高，是檸檬生物活性成分的主要來源之一，類檸檬苦素次之。以上結(jié)果表明該方法操作簡便、靈敏可靠，適用于檸檬中多類型生物活性成分的快速篩查定量分析，為我國檸檬資源的開發(fā)利用提供重要的參考價值。該方法有通用性，為柑橘生物活性成分的定性定量研究提供了簡便、可靠的檢測分析技術(shù)。