重樓2種基原植物不同部位中9個(gè)皂苷含量比較△

王旭星，賈天穎，楊成金，文佳，徐新房，蘇鈦，葉先文，程水清，王璇，李向日*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥炮制研究中心/中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102488；

2.北京同仁堂股份有限公司 同仁堂制藥廠，北京 102629；

3.云南白藥集團(tuán)中藥資源有限公司，云南 昆明 650500

重樓又名金錢重樓、白甘遂、草河車、蚤休[1]，為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz 或七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara 的干燥根莖[2]，主產(chǎn)于云南、貴州、四川等西南各省[3]。其味微苦，性寒，有小毒，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效[2]。重樓的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括甾體皂苷、蛻皮激素、萜等類成分。其中主要的藥效成分為甾體皂苷類成分[4]，此類化合物的苷元母核由6 個(gè)環(huán)組成，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為薯蕷皂苷和偏諾皂苷2 類，兩者的區(qū)別在于母核C-17 位是否有含氧取代（偏諾皂苷有取代）[5]。重樓屬植物中的大部分皂苷是由這2 種皂苷元通過羥化、脫水、苷化形成[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓有較好的抗炎[7]、抗腫瘤[8]、止血[9]、抗氧化[10]、促進(jìn)子宮收縮[11]等藥理作用，其中薯蕷皂苷的抗腫瘤作用強(qiáng)于偏諾皂苷，而止血作用弱于偏諾皂苷[12]。

重樓基原植物生長周期長，其種子具有“二次休眠”的特性，需要經(jīng)歷形態(tài)成熟和生理成熟2 個(gè)階段，至少2 年才能萌發(fā)，而且種子成熟后還容易發(fā)生霉變、腐爛現(xiàn)象[13]，正常生長的情況下，從栽種至其成熟需要8～10 年[14]。再加上其藥用價(jià)值大、市場需求量高等原因，導(dǎo)致野生重樓資源迅速減少，市場上以假充真、以劣充優(yōu)現(xiàn)象嚴(yán)重[15]。對(duì)重樓基原植物不同部位的充分利用是解決資源浪費(fèi)問題和減少市場亂象的有效手段。

目前已有針對(duì)重樓地上部分的研究。陳昌祥等[16]研究表明，云南重樓地上部分莖葉中含有11 個(gè)與地下根莖相同的甾體皂苷類成分，由此可見重樓地上部分可以作為單一成分提取的原料而得到充分利用。唐娜等[17]從北重樓P.verticillataM.Bieb.根中分離出了2個(gè)甾體皂苷和4個(gè)甾酮類化合物。本研究采用實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法對(duì)重樓2個(gè)基原植物3個(gè)部位（根莖、須根和芽）中9 個(gè)甾體皂苷類成分含量進(jìn)行比較，以期探究重樓不同基原、不同部位中重樓皂苷含量的差異，為重樓藥材資源的充分利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀（2489 型紫外檢測器，Empower 色譜工作站）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA-1004 型電子分析天平（上海天平儀器廠）；PL2002 型電子天平（梅特勒-托科多儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)：111590-201604，純度：93.6%）、重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)：111591-201604，純度：91.4%）、重樓皂苷Ⅵ（批號(hào)：111592-201604，純度：97.0%）、重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)：111593-201604，純度：94.0%）、重樓皂苷Ⅳ（批號(hào)：111707-201703，純度：96.1%）均購于中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品重樓皂苷Ⅲ（批號(hào)：CF0227QC14，純度：98%）、重樓皂苷Ⅴ（批號(hào)：Y19F7H9835，純度：98%）、重樓皂苷H（批號(hào)：C12A8G33615，純度：98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品重樓皂苷D（批號(hào)：16063003，純度：97%）購于成都普菲德生物科技有限公司；色譜級(jí)乙腈（Fisher 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

野外采集新鮮云南重樓藥材8 批、七葉一枝花藥材7 批，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員鑒定分別為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz 和七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara，將藥材不同部位進(jìn)行分離，標(biāo)本藏于云南省藥物研究所。不同部位樣品信息見表1，典型圖片見圖1。

圖1 重樓藥材不同部位樣品（DCL-01-024）

表1 云南重樓和七葉一枝花樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件

十八烷基硅烷鍵合硅膠SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，15%～30%A；30～35 min，30%A；35～48 min，30%～43%A；48～53 min，43%A；53～60 min，43%～50%A；60～65 min，50%A；65～75 min；50%～60%A）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流速為1.1 mL·min-1，檢測波長為203 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D 和重樓皂苷H 適量，精密稱定，加甲醇制成含9 個(gè)皂苷分別為2.104、1.984、2.172、3.084、0.354、1.988、2.112、0.370、1.640 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取上述重樓樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。?00 W，40 kHz）2 次，每次30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，合并溶液置于100 mL 旋蒸瓶中，在40 ℃旋干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 樣品測定

含量測定方法采用課題組前期建立的方法[18]，已進(jìn)行提取工藝和方法學(xué)研究，結(jié)果均符合規(guī)定，色譜圖見圖2。重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ的分離度分別為4.38、2.00、2.36、2.89、5.55、3.21、1.83、1.64、5.37，達(dá)到了定量要求。

圖2 重樓中9個(gè)皂苷HPLC圖

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)成分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。采用SIMCA 13.0軟件對(duì)重樓藥材不同基原不同部位的9個(gè)重樓皂苷含量進(jìn)行主成分分析（PCA）；采 用Origin 9.8 插 件Heat Map Dendrogram 對(duì)9 個(gè)重樓皂苷含量進(jìn)行聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 含量測定

重樓2 種基原3 個(gè)部位中9 個(gè)重樓皂苷含量測定結(jié)果見表2，對(duì)含量測定結(jié)果進(jìn)行綜合分析見表3。

表2 重樓中9個(gè)皂苷成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=4）

表3 重樓2種基原、3個(gè)不同部位中9個(gè)重樓皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=6）

表3 重樓2種基原、3個(gè)不同部位中9個(gè)重樓皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=6）

注：DG.云南重樓根莖；QG.七葉一枝花根莖；DX.云南重樓須根；QX.七葉一枝花須根；DY.云南重樓芽；QY.七葉一枝花芽；同一基原的須根和芽與根莖比較，*P＜0.05；不同基原的同一部位比較，#P＜0.05；—表示未檢出。

重樓皂苷的含量受環(huán)境影響較大，相同基原和部位不同批次重樓的皂苷含量存在著較大的個(gè)體差異。云南重樓根莖中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ和重樓皂苷Ⅳ的含量均顯著高于七葉一枝花根莖，重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D 和重樓皂苷H 的含量低于七葉一枝花根莖；云南重樓須根中重樓皂苷Ⅶ的含量顯著高于七葉一枝花須根；云南重樓芽中重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷D 和重樓皂苷H 的含量顯著低于七葉一枝花芽。通過比較相同基原重樓的不同部位9個(gè)皂苷含量可以發(fā)現(xiàn)，云南重樓須根中重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ的含量比根莖和芽中高，其余皂苷都比這2 個(gè)部位高；七葉一枝花的3 個(gè)部位中，皂苷含量整體上表現(xiàn)出芽最高，須根最低。綜合來看，9 個(gè)重樓皂苷的含量在不同基原和不同部位中均表現(xiàn)出較大差異，這提示臨床將不同基原的重樓分開使用及凈制去除須根和芽具有必要性。

9 個(gè)皂苷的結(jié)構(gòu)存在差異，根據(jù)苷元C-17 位是否有含氧取代可以分為兩大類，即薯蕷皂苷和偏諾皂苷，這兩大類皂苷的糖基部分主要由鼠李糖基、葡萄糖基和阿拉伯糖基組成，兩者的皂苷元結(jié)構(gòu)和具體糖鏈信息分別見圖3和表4。在生物合成上，先合成薯蕷皂苷元，然后糖苷化生成各種薯蕷皂苷，或者經(jīng)過羥化生成偏諾皂苷元，再苷化生成各種偏諾皂苷。對(duì)9 個(gè)皂苷的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5，重樓皂苷Ⅰ與其余4種薯蕷皂苷存在著顯著的正相關(guān)性，與重樓皂苷Ⅶ存在著顯著的負(fù)相關(guān)性。除此之外，重樓皂苷Ⅱ與重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅶ，重樓皂苷Ⅲ與重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅶ，重樓皂苷Ⅳ與重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H，重樓皂苷Ⅴ與重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷D、重樓皂苷H，重樓皂苷Ⅵ與重樓皂苷D、重樓皂苷H，重樓皂苷Ⅶ與重樓皂苷H，重樓皂苷D與重樓皂苷H 均具有顯著的相關(guān)性。說明不同皂苷之間可能存在著轉(zhuǎn)化關(guān)系，在重樓藥材生長過程中，受不同光照、溫度和濕度等的影響，其轉(zhuǎn)化方向可能存在差異，同種基原和部位不同批次的重樓皂苷含量也存在著較大個(gè)體差異。

表4 重樓皂苷糖鏈結(jié)構(gòu)

表5 重樓樣品中不同皂苷含量的相關(guān)系數(shù)

圖3 薯蕷皂苷元與偏諾皂苷元結(jié)構(gòu)

由于薯蕷皂苷和偏諾皂苷的藥理作用存在差異，因此重點(diǎn)對(duì)2種基原重樓3個(gè)部位的薯蕷皂苷和偏諾皂苷類成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖4。同種部位不同基原比較結(jié)果表明，云南重樓根莖中的薯蕷皂苷含量顯著高于七葉一枝花根莖，而偏諾皂苷含量顯著低于七葉一枝花根莖；2 種基原重樓須根中薯蕷皂苷和偏諾皂苷含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；云南重樓芽中2 類皂苷含量均低于七葉一枝花。同一基原不同部位比較結(jié)果表明，云南重樓須根中薯蕷皂苷含量顯著低于根莖，而偏諾皂苷含量顯著高于根莖；七葉一枝花須根中偏諾皂苷含量顯著低于根莖，而薯蕷皂苷含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；七葉一枝花芽的薯蕷皂苷含量顯著高于根莖，而偏諾皂苷含量顯著低于根莖。綜合來看，重樓不同基原、不同部位的薯蕷皂苷與偏諾皂苷差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在臨床使用時(shí)應(yīng)根據(jù)具體的情況將來源不同的重樓根莖應(yīng)用于不同的病癥，在制劑提取時(shí)可將不同部位當(dāng)作提取薯蕷皂苷或偏諾皂苷的原料。

圖4 云南重樓和七葉一枝花不同部位薯蕷皂苷和偏諾皂苷含量比較（,n=6）

3.2 重樓不同基原、部位皂苷含量聚類分析

對(duì)2 種基原重樓3 個(gè)部位9 個(gè)皂苷的含量進(jìn)行聚類分析（圖5）。結(jié)果表明，2個(gè)基原重樓藥材的3個(gè)部位物質(zhì)基礎(chǔ)存在差異，根據(jù)聚類結(jié)果可以將不同基原重樓藥材不同部位大致分為三大類，其中云南重樓根莖與云南重樓芽為一類，七葉一枝花芽為一類，2 種基原重樓的須根和七葉一枝花的根莖分為一類。對(duì)不同皂苷進(jìn)行聚類可以將9 個(gè)皂苷分為3類，第1類是重樓皂苷Ⅱ，屬于薯蕷皂苷，第2類是重樓皂苷Ⅶ，屬于偏諾皂苷，其他7 個(gè)皂苷為第3類。綜合來看，云南重樓根莖中的薯蕷皂苷類成分主要是重樓皂苷Ⅱ，七葉一枝花根莖中的偏諾皂苷類成分主要是重樓皂苷Ⅶ，可以考慮以重樓皂苷Ⅱ來代表云南重樓根莖薯蕷皂苷含量水平，以重樓皂苷Ⅶ來代表七葉一枝花根莖偏諾皂苷含量水平。

圖5 不同基原重樓、不同部位與9個(gè)甾體皂苷含量聚類分析熱圖

對(duì)2 種基原重樓3 個(gè)部位中9 個(gè)重樓皂苷含量進(jìn)行PCA，所得得分圖及載荷圖見圖6，通過降維處理之后，可以看出不同基原的重樓根莖、芽之間具有一定的差異，同種基原非藥用部位和藥用部位之間的皂苷含量存在差異；結(jié)合2 類皂苷含量及藥理活性的差異，可以考慮將2 種基原的重樓分開使用，并且用的時(shí)候應(yīng)去除非藥用部位，但仍需更多的藥效學(xué)研究和更多批次樣品數(shù)據(jù)的支撐。以9 個(gè)重樓皂苷含量為參數(shù)分別對(duì)云南重樓和七葉一枝花的根莖、須根和芽做PCA，得到其載荷圖見圖6B，各類重樓皂苷在區(qū)分重樓2種基原、3個(gè)部位時(shí)均具有較強(qiáng)的貢獻(xiàn)度，其中重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ在區(qū)別云南重樓根莖和其他基原、部位時(shí)可作為質(zhì)量標(biāo)志物，重樓皂苷Ⅶ在區(qū)分七葉一枝花根莖和其他基原、部位時(shí)可作為質(zhì)量標(biāo)志物。

圖6 2種重樓基原、3個(gè)部位與皂苷含量PCA得分及載荷圖

4 討論

本研究運(yùn)用HPLC同時(shí)測定了2種基原重樓藥材3個(gè)部位中9個(gè)重樓皂苷的含量，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同基原和不同部位的9 個(gè)重樓皂苷含量差異較大，同一基原同一部位受產(chǎn)地或年限等影響，皂苷含量也表現(xiàn)出較大差異。由于這種客觀的差異性及9 個(gè)皂苷之間存在的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，難以對(duì)不同基原和不同部位的單個(gè)皂苷含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析且缺乏實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，因此本研究著重對(duì)兩大類藥理作用不同的重樓皂苷（薯蕷皂苷和偏諾皂苷）含量進(jìn)行綜合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南重樓和七葉一枝花的2 類皂苷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，云南重樓根莖中含有的以抗腫瘤為主要作用的薯蕷皂苷含量顯著高于七葉一枝花根莖，七葉一枝花根莖中含有的以止血為主要作用的偏諾皂苷含量顯著高于云南重樓根莖。因此，以止血功效為主的中成藥，如云南紅藥膠囊和宮血寧膠囊等，宜選用七葉一枝花入藥，而以抗腫瘤為主要功效的中成藥，如肝復(fù)樂片等，更宜選用云南重樓入藥。但在選擇基原時(shí)，還要綜合考慮各基原的資源分布等情況。

由于重樓藥材在采挖過程中會(huì)帶有須根和芽，在臨床上煎煮使用時(shí)，須根過濾不干凈可能會(huì)引起喉頭嗆咳水腫，因此傳統(tǒng)的凈制要求去除須根和芽。鑒于野生重樓資源的珍貴和稀少，本研究通過對(duì)須根和芽的皂苷含量進(jìn)行測定以探討重樓非藥用部位的藥用價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，須根和芽的重樓皂苷含量與根莖有較大的差異，其存在會(huì)影響藥用部位中皂苷的含量及皂苷之間的比例關(guān)系，因此從含量上分析，凈制去除須根和芽具有一定的科學(xué)道理。除此之外還發(fā)現(xiàn)，七葉一枝花芽中的薯蕷皂苷和偏諾皂苷均顯著高于云南重樓芽，說明七葉一枝花芽作為單一皂苷或某類皂苷提取原料具有較高使用價(jià)值。兩者的須根差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩者所含偏諾皂苷含量顯著高于薯蕷皂苷含量，作為偏諾皂苷的提取原料具有較高使用價(jià)值。

另外，鑒于重樓皂苷標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，考慮到重樓皂苷Ⅱ在各個(gè)部位中含量都較高，而且分離度較好，因此在實(shí)驗(yàn)室前期研究[18]中，以重樓皂苷Ⅱ?yàn)閰⒄沼?jì)算了重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的相對(duì)校正因子，分別為1.01、0.67、1.11、1.37、1.00、1.19、1.08、1.21、1.28，相對(duì)保留時(shí)間分別為0.73、0.75、0.76、0.79、1.00、1.03、1.04、1.06、1.11，可為采用一測多評(píng)法計(jì)算9 種甾體皂苷的含量提供參考。

雖然重樓皂苷的含量受環(huán)境影響較大、組內(nèi)差異顯著，但是本研究通過聚類分析和PCA 發(fā)現(xiàn)不同基原不同部位的物質(zhì)基礎(chǔ)存在規(guī)律性差異，不僅發(fā)現(xiàn)了2 種基原重樓藥用部位之間的差異，為臨床合理應(yīng)用提供了初步的思考，也發(fā)現(xiàn)了非藥用部位的使用價(jià)值，為重樓資源的充分開發(fā)使用提供參考。