劉志恒袁霞紅劉 林*

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學,長沙 410208)

隨著物質(zhì)條件和生活水平的提高,不僅是生理上的疾病,同時心理精神類疾病的發(fā)生率也同樣在提升。根據(jù)流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,抑郁癥已成為嚴重威脅人類健康的第二大疾病[1],其以顯著而持久的情緒低落為主要臨床特征,主要表現(xiàn)有心境低落、意志活動減退、思維遲緩和認知功能損害,同時可伴有睡眠障礙、焦慮,甚者可出現(xiàn)嚴重的自殘或自殺行為。盡管現(xiàn)在大眾對抑郁癥的關注日益提高,但其發(fā)病機制尚未明確,可能與遺傳因素、生物因素、社會因素等相關。現(xiàn)有的臨床藥物治療方案,存在其毒副作用明顯,停藥后容易復發(fā)等問題,而且目前在抗抑郁藥物的研發(fā)進展上并無突破[2]。相較之下,以祖國醫(yī)學為主要治療手段的臨床治療中明顯取得相對不錯的療效。所以從中醫(yī)藥基礎研究出發(fā),以祖國醫(yī)學的角度去探索抑郁癥的發(fā)病機制和相關藥物的治療機制是一個新的突破口。根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學中“同病異治”和“辨證論治”的理論指導,抑郁癥患者群體有著相對一致的主癥和相對差異較大的伴發(fā)癥,所以針對其個體的不同情況,采取的藥物和治療方案也不相一致。因此,在中醫(yī)藥基礎研究中,建立與傳統(tǒng)醫(yī)學相對應的證候抑郁證動物模型是關鍵環(huán)節(jié)。

1 抑郁癥動物模型的制備

理想的抑郁癥造模動物主要有兩個要求:第一點是其生理病理機制與人類高度相似;第二點是與人類抑郁癥發(fā)病機制相似,且抑郁癥癥狀能被人類使用所使用的抗抑郁藥物所緩解[3]。這些要求都是為了更好的模擬人類機體,從而對抑郁癥發(fā)病機制和治療方法的研究產(chǎn)生更具有可行性且有信服力的結(jié)果。

1.1 造模動物種類及品系的選取

目前應用于抑郁癥造模的動物主要有大鼠、小鼠、非人靈長類動物[4]等,其中以小鼠、大鼠最為常用[5]。雖然非人靈長類動物與人類有較高的親緣關系,情感神經(jīng)中樞和內(nèi)分泌都與人有較高的重合度,因而作為最理想的實驗動物[6],但其造價昂貴,樣本量稀少,因此不多論述。目前最常用于制備抑郁癥動物模型的動物種類是小鼠、大鼠。

不同品系的小鼠都有其獨特的表型跟適用方向,是目前疾病動物研究中應用最廣的動物模型。其具有體積小、價格低、同時還可從網(wǎng)絡獲取基因組測序圖譜、方便采取基因工程技術誘導小鼠模型建立等優(yōu)勢[7]。目前國內(nèi)外常用的小鼠有:KM小鼠[8-9],BALB/c小 鼠[10]、C57BL/6J小 鼠[11-12]等。與小鼠相比較,抑郁癥造模實驗中大鼠的體重變化和行為學觀測數(shù)據(jù)更為明顯,使抗抑郁藥物的效果及其指標更具有參考性。常用的大鼠品系主要有Sprague Dawley(SD)大鼠[13]、Wistar大鼠[14]、Wistar Kyoto(WKY)大鼠[15-16],Flinder Resistant Line(FSL)大鼠[17]、Fawn-Hooded(FH)大鼠[18]。

1.2 模型制備方法

應激作為人類抑郁癥發(fā)病的主要原因之一,且通過人為手段給予動物不同的應激因素來制備的抑郁癥動物模型能有效地被臨床抗抑郁藥物所緩解,故應激造模是目前最常用的方法之一,其中包括行為絕望模型[19-20]、習得性無助模型[21]、社會應激模型[22-23]、慢性不可預知溫和性模型等。慢性不可預知溫和性應激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)是應激模型中最為常用的一種,通過每日不定時給予動物不同的較溫和的刺激因子,一般是兩種以內(nèi),連續(xù)2 d不重復,從而對動物造成長時間穩(wěn)定的應激壓力,引起實驗動物類抑郁癥相關行為的出現(xiàn)[24]。該造模方法有效地避免了單一應激可能會引起動物的適應性的問題,同時具備高度有效性,所以可靠性較強[25],是一種較為廣泛使用的抑郁癥造模方法。

除了應激造模外,還有手術造模、藥物誘導造模、遺傳造模等方式。手術造模穩(wěn)定性高、且無藥物交互影響,但模型制備難度高,不同動物操作不一,而且難以保證實驗動物的操作一致性。藥物誘導模型是針對目前廣泛認可的抑郁癥發(fā)病機制,通過藥物的方式去誘導抑郁癥的發(fā)生[26-27],主要用于篩選專一性靶點的抗抑郁藥物。但以藥物誘導的抑郁癥與人類抑郁癥的發(fā)病機制有一定的差異,因此該造模方式受到一定的使用限制[28]。遺傳造模是通過近代雜交或者基因手段去構建抑郁癥動物模型。有研究表明,抑郁癥有明顯的家族易感性,且與部分基因存在關聯(lián)[29],但是通過對單一基因或多個基因位點執(zhí)行基因敲除等手段構建的抑郁癥動物模型尚不穩(wěn)定,且存在重復性不高、造價昂貴等問題,所以一般較少使用。

2 病證結(jié)合動物模型進展

抑郁癥,屬于傳統(tǒng)醫(yī)學里的“郁證”范疇?，F(xiàn)代不同的醫(yī)家在繼承前人的知識下對抑郁癥又有了不同的理解與闡述。有醫(yī)家認為肝主疏泄,對情志有重要的調(diào)節(jié)作用,故情志內(nèi)傷以致肝氣郁結(jié),肝的生理特性受到影響,則發(fā)為郁證[30]。而肝、脾二者各為木土,根據(jù)五行相生相克,肝氣郁結(jié),易木旺乘土,故脾亦失健運,此理論是“見肝之病,知肝傳脾”思想重要體現(xiàn)[31],所以臨床上既有肝氣郁結(jié)證型,也有肝郁脾虛證型病人。同時有醫(yī)家在臨床上對抑郁癥患者進行觀察,發(fā)現(xiàn)其常伴隨神疲乏力,反應遲鈍,憂愁多思等心神失養(yǎng),心神不振癥狀,從而提出陽氣抑竭、神頹志衰也是抑郁癥的病機之一[32]。還有醫(yī)家主張腎主精,肝藏血,而精血同源,肝腎藏精血以充養(yǎng)腦髓,只有精血充足,腦髓得以充盈,人的精神活動得以正常維持[33]。若肝腎的生理功能失調(diào),也容易發(fā)生抑郁癥?？偠灾?基于傳統(tǒng)醫(yī)學中的“整體觀念”,不同臟腑病變都有可能導致抑郁癥的發(fā)生。臨床上主要包括了這幾種證型:肝氣郁滯、肝郁脾虛、肝腎陰虛等[34]。

動物實驗是中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學接軌的重要橋梁,所以構建適合于中醫(yī)藥研究的動物模型是重中之重。以傳統(tǒng)醫(yī)學的角度看來,一個疾病的發(fā)生不是單一的病因起作用,而是綜合性的病因與機體內(nèi)在因素相互作用,最終呈現(xiàn)出的一個病理狀態(tài)[35]。很明顯,單純地構建疾病動物模型不能滿足中醫(yī)學概念中的“整體觀念”以及“辨證論治”。因此在制備單一的抑郁癥動物模型基礎上,結(jié)合證候模型來模擬人類抑郁癥發(fā)病以及其證型特點,以構建病證結(jié)合抑郁癥動物模型運用于中醫(yī)藥基礎研究[36]。

2.1 肝郁氣滯證郁證動物模型

目前肝郁氣滯證型抑郁癥動物模型的具體制備方式主要是CUMS造模和慢性束縛性應激(chronic restraint stress,CRS)造模。有學者基于傳統(tǒng)醫(yī)學中“肝屬木,主疏泄,喜條達而惡抑郁”的理論,認為肝郁氣滯模型造模的關鍵應是造成“郁怒”,故采用慢性束縛性應激造模來構建肝郁氣滯證型抑郁癥動物模型[37]。通過將小鼠被困于自制的束縛管中,只有四肢能進行微小的動作,且隨著小鼠體重的增加,體積增大,造模小鼠全身被限制于狹小空間內(nèi),使其郁怒,從而構建肝郁氣滯證型抑郁癥動物模型。其動物模型在符合抑郁癥相關行為學改變的前提下,與同實驗的肝郁脾虛證型抑郁癥動物模型相比,曠場自我活動次數(shù)明顯要少,符合肝郁氣滯證表現(xiàn)。而運用CUMS構建肝郁氣滯型抑郁癥小鼠,同樣是通過“郁怒”病因來誘發(fā)肝的疏泄失常,氣機不暢,以致肝郁氣滯證型郁證的發(fā)病[38]。造模成功后,小鼠蔗糖水攝取量減少, 表現(xiàn)了對獎賞的不敏感,同時還有體重增加速度減緩,內(nèi)分泌系統(tǒng)活性異常等一系列表現(xiàn),符合臨床上抑郁癥患者的表現(xiàn)。而在此動物模型上使用具有疏肝理氣作用的逍遙散,能明顯減輕甚至消除其抑郁癥癥狀,以證明該肝郁氣滯病證結(jié)合模型的成功[39]?，F(xiàn)有研究者通過使用疏肝、疏肝健脾、健脾三種不同主要功效的代表中藥復方湯劑比較不同治則對肝郁氣滯證抑郁癥動物模型海馬中神經(jīng)遞質(zhì)相關表達基因的不同干預作用[40]。結(jié)果顯示疏肝和疏肝健脾兩種代表方劑對該動物模型都有著明顯的抗抑郁作用,而健脾組的中藥復方則無明顯作用。這不僅說明了在肝郁氣滯證型抑郁癥的治療中,疏肝理氣是其最重要的治則,可對大鼠海馬的神經(jīng)遞質(zhì)受體基因表達有促進作用,同時也驗證了該證候動物模型的成功制備,具備證候的獨特性。

2.2 肝郁脾虛證郁證動物模型

目前針對中醫(yī)藥研究實驗所使用的肝郁脾虛證型抑郁癥動物模型基本為CRS動物模型[41]或CUMS動物模型。近來有學者基于“苦寒敗胃,而胃與脾相表里”的中醫(yī)學理論,結(jié)合CUMS造模方法和大黃水溶液灌胃構建肝郁脾虛證型抑郁癥動物模型。其模型小鼠表現(xiàn)活動速度減緩、活躍度下降、蔗糖偏好指數(shù)降低、懸尾不動時間和強迫游泳不動時間延長等典型抑郁癥狀;同時還出現(xiàn)進食欲望下降、體重增長緩慢、大便稀溏的肝郁脾虛癥狀,說明該小鼠模型同時具備抑郁癥表現(xiàn)和肝郁脾虛證的相關表現(xiàn)[42]。也有研究者根據(jù)“味過于酸,肝氣以津,脾氣乃絕”的中醫(yī)理論,在CRS制備的肝郁氣滯證型抑郁癥動物模型基礎上,同時全天給動物飲用5%食醋溶液[37]。該模型相對于單純的CRS模型在曠場實驗中爬行格數(shù)明顯降低,強迫性游泳不動時間延長,可能與“脾主肉”有關,脾虛則肌肉萎縮,進而少動,這對病證結(jié)合動物模型制備的探索和評估證候模型有一定啟示作用。

有研究表明BALB/c小鼠在不同的抑郁癥造模方式下均表現(xiàn)出明顯且穩(wěn)定的氣虛證候易感性體質(zhì),主要表現(xiàn)為前爪抓力下降,負重游泳時間下降和掌紋血色度下降等[43]。同時該小鼠的肝郁脾虛證郁證癥狀能被健脾益氣代表中醫(yī)方劑四君子湯所逆轉(zhuǎn),小鼠肌肉和海馬中PKA-CREB信號表達均明顯增加[44]。此說明了該品系所制備的抑郁癥動物模型符合氣虛證候,同時還提示了四君子湯改善氣虛證候治療抑郁癥的機制可能與PKA-CREB信號通路有關,為探究抑郁癥發(fā)病機制提供新的思路。接著再有進一步的研究,以理氣為主要功效的中藥復方越鞠丸治療BALB/c小鼠的氣虛證抑郁癥并無四君子湯般顯著。雖然對小鼠抑郁癥同樣有治療作用,也提高了肌肉和海馬中PKA-CREB信號表達,但其氣虛證癥狀并無改善[45]。此說明了越鞠丸也同樣可能是通過調(diào)節(jié)PKA-CREB信號通路來達到治療抑郁癥的效果。通過構建不同的病證結(jié)合抑郁癥動物模型,以不同的中藥復方湯劑去探索其共同點,也許可以為抑郁癥的發(fā)病基礎機制提供一種新思路,同時其中不同的點也許可以為中醫(yī)藥不同證型的區(qū)別提供現(xiàn)代理論基礎,也是為抑郁癥患者個體間的差異提供更好的治療方案以及研發(fā)更好的對癥藥物。

2.3 肝腎陰虛證郁證動物模型

有研究通過對比CUMS結(jié)合溫燥藥灌胃、CUMS結(jié)合懸尾以及CUMS結(jié)合甲狀腺激素注射此3種肝腎陰虛證抑郁癥動物模型制備方法,以尋求一種較符合肝腎陰虛證的模型[46]。從結(jié)果來看,CUMS結(jié)合甲狀腺激素注射誘導的肝腎陰虛證抑郁癥模型大鼠處于一種陰虛型亢奮的狀態(tài);其表現(xiàn)為易驚怒、大便干燥、毛濕無光澤、捉拿時反應劇烈,因而明顯較其他兩種制備方法更具有代表性[47]。但通過化學藥物誘導的中醫(yī)證候相關表現(xiàn)存在一個共同的缺點,即由藥物誘導所表現(xiàn)出來的癥狀與中醫(yī)理論中的病因病機不符。有研究表示,以滋腎陰為主要功效的憂慮康液不僅能對陰虛證抑郁癥小鼠的行為學有逆轉(zhuǎn)作用,同時能修復腎、腎上腺、足跖汗腺細胞形態(tài)學損傷,以及降低血漿環(huán)腺苷酸(cAMP)含量,甚至高劑量的憂慮康液比滋補腎陰的代表方六味地黃丸有著更好的治療效果。也有研究表示,以滋補肝腎為主要功效的滋腎益腦方在由CUMS結(jié)合甲狀腺激素注射制備的肝腎陰虛證抑郁癥小鼠身上,可對抗由慢性應激引起的行為學變化,同時還可使海馬區(qū)的BDNF、TrKB基因表達明顯升高[48-49]。這些研究都不單單說明了該中藥復方湯劑的臨床意義和其治療藥理機制,同時也為探索抑郁癥的發(fā)病機制提供了新的思路。

2.4 其他證型

除了上述證型,傳統(tǒng)醫(yī)學中的郁證還有其他證型,如心脾兩虛、氣郁化火、陽虛[50]等。有研究指出通過利血平注射造模的抑郁癥小鼠出現(xiàn)體溫下降以及行動能力下降等陽虛癥狀,因此可把該模型用作陽虛證抑郁癥的研究中。而臨床上針對心脾兩虛證和氣郁化火證兩種郁證的復方中藥湯劑,即歸脾湯[51]和丹梔逍遙散[52]在抑郁癥實驗中對CUMS抑郁癥動物模型都有明顯的抗抑郁效果,故其藥理機制還需要進一步的探索。在抑郁癥臨床治療上中醫(yī)藥治療具有很高的研究價值。

3 小結(jié)與展望

目前抑郁癥臨床西藥治療方案,存在其毒副作用明顯,停藥后容易復發(fā)等問題,而以祖國醫(yī)學為主要治療手段的臨床治療中明顯取得相對不錯的療效。所以以祖國醫(yī)學的角度出發(fā),探索以中醫(yī)藥治療為主的臨床治療方案,以中醫(yī)藥理論的視角去探索抑郁癥的發(fā)病機制,也許能夠成為抑郁癥發(fā)病機制的突破點。

動物實驗是所有醫(yī)學基礎研究的基石,但目前中醫(yī)藥基礎研究的動物實驗環(huán)節(jié)尚存在著問題。目前最適用于中醫(yī)藥基礎研究的動物模型是病證結(jié)合動物模型,其優(yōu)點主要有:(1)其是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學的病理病因理論復制出來的疾病模型,所以符合現(xiàn)代醫(yī)學理論對動物模型的要求;(2)其同樣基于中醫(yī)整體觀念及辨證論治等中醫(yī)藥特色傳統(tǒng)理論,把人類疾病某特定階段所表現(xiàn)出來的癥狀在動物身上加以復制,使其具有中醫(yī)藥特色;(3)其同時符合現(xiàn)代醫(yī)學與傳統(tǒng)醫(yī)學的相關理論,所以對于中醫(yī)藥基礎研究來說,病證結(jié)合動物模型是中醫(yī)藥研究與現(xiàn)代醫(yī)學的結(jié)合點。但缺點同樣是明顯的:(1)目前評估證候動物模型成功與否的標準尚未能從定性向定量轉(zhuǎn)變,即使有學者提出相關的定量標準也沒有得到大多數(shù)認可;(2)難以用現(xiàn)代醫(yī)學的生化指標或者病理標準去評估證候動物模型是否成功;(3)病證結(jié)合動物模型的制備尚未有統(tǒng)一的標準,都是依據(jù)各自對傳統(tǒng)醫(yī)學的理解來設置相關的應激因素,通常是單一因素或多個因素來制備,這與人類生活中由綜合性病因引起疾病的發(fā)生有一定的差別;(4)與單純的疾病動物模型制備和證候動物模型制備相比,病證結(jié)合模型的制備都要困難,且重復性較低,不利推廣。目前對于病證結(jié)合動物模型的評估大多采取以方測證或者以藥測證的方法評估動物模型證候方面的表現(xiàn),同時用現(xiàn)代醫(yī)學的行為表現(xiàn)學、生理病理學表現(xiàn)去評估動物模型疾病方面的表現(xiàn)。病證結(jié)合動物模型作為一種現(xiàn)代醫(yī)學知識理論和傳統(tǒng)醫(yī)學知識理論相結(jié)合的產(chǎn)物,對中醫(yī)藥基礎研究有著不可或缺的作用,雖然目前問題也同樣存在著許多,但今后會在不斷的發(fā)展下變得完善,為中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代醫(yī)學理論相融合作出巨大的貢獻。