張亞中，劉軍玲，程世云，胡沖，韓玲玲，魏鋒，馬雙成

1.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051；

2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230051；

3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

中藥是中醫(yī)藥的重要組成部分，而中藥標(biāo)準(zhǔn)體系的建立事關(guān)中醫(yī)藥的健康發(fā)展?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）作為上市準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)起到反制的杠桿作用，對中藥質(zhì)量的控制有較強(qiáng)的規(guī)范作用。但目前也存在不少爭議，有人認(rèn)為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在的問題及原因主要表現(xiàn)為照搬化學(xué)藥品的模式和對“度”把握不準(zhǔn)。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究須在傳承中藥的基礎(chǔ)上，運(yùn)用傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，堅(jiān)持中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與臨床療效相對應(yīng)的科學(xué)理念，制定合理的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。劉昌孝院士針對這一問題，于2016 年提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的新概念[1]，2019年又發(fā)表專題報(bào)道“中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念、核心理論與研究方法”，進(jìn)一步闡述了中藥質(zhì)量標(biāo)志物核心理論和研究方法，解析了中藥質(zhì)量標(biāo)志物的定義和科學(xué)內(nèi)涵，并從有效性、特有性、傳遞與溯源、配伍環(huán)境及可測性5 個(gè)方面概要闡述了質(zhì)量標(biāo)志物的核心理論和研究方法，實(shí)現(xiàn)了中藥質(zhì)量控制理論、思路和方法的質(zhì)的飛躍[2-4]。筆者在長期從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究中發(fā)現(xiàn)，很多中藥材，尤其是果實(shí)和種子類中藥材在采收加工成為藥材后還存在自身體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，只有闡述這個(gè)過程才能找到真正的質(zhì)量標(biāo)志物，制定合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究以補(bǔ)骨脂為例，探討中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定思路。

補(bǔ)骨脂又稱黑故子、破故紙，為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，為1 年生草本植物，秋季果實(shí)成熟時(shí)采收果序，曬干，搓出果實(shí)，除去雜質(zhì)。其味辛、苦，性溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉等功效，用于腎陽不足、陽痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛、腎虛作喘、五更泄瀉等，外用可消風(fēng)祛斑，治療白癜風(fēng)、斑禿[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)骨脂含有香豆素、單萜酚、黃酮及苯并呋喃等多種化學(xué)成分[6-7]，其中香豆素類成分主要包括補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等[8-9]。由于補(bǔ)骨脂價(jià)格過低、產(chǎn)量低、費(fèi)工、費(fèi)時(shí)，國內(nèi)已經(jīng)有近20 年沒有種植，主要靠從緬甸、越南等國進(jìn)口，以野生為主。補(bǔ)骨脂早在唐宋年間就已經(jīng)作為藥材使用，是我國傳統(tǒng)常用中藥材，用量較大，是經(jīng)典方劑二神丸、四神丸、加味青娥丸等制劑的主要組成藥物，因此，有必要嚴(yán)格控制其質(zhì)量以保障用藥安全。

1 補(bǔ)骨脂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀及問題

補(bǔ)骨脂藥材和飲片標(biāo)準(zhǔn)主要收載于《中國藥典》2020 年版[10]，分別收載了補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂2 種飲片規(guī)格，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括【性狀】【鑒別】【檢查】及【含量測定】等。除此之外，部分地方炮制規(guī)范也收載了這2 種飲片規(guī)格，檢驗(yàn)項(xiàng)目均沒有超出《中國藥典》2020年版的收載范圍。

2019 年，安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院對243 批補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂進(jìn)行檢驗(yàn)，樣品地域覆蓋了全國31 個(gè)省、自治區(qū)、直轄市，抽自65 家飲片生產(chǎn)企業(yè)、82個(gè)批發(fā)經(jīng)營單位、21家零售藥店及75家醫(yī)療機(jī)構(gòu)。檢驗(yàn)結(jié)果表明，共32 批樣品不合格，不合格率為13.2%，不合格項(xiàng)目全部為含量測定項(xiàng)，不合格比例較高。而不合格原因是藥材質(zhì)量問題還是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)問題值得深入研究。

2 補(bǔ)骨脂含量測定不合格原因分析

《中國藥典》自1963 年版開始收載補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂飲片，之后歷版《中國藥典》均有收載。早期收載補(bǔ)骨脂藥材標(biāo)準(zhǔn)僅包含鑒別項(xiàng)，鹽補(bǔ)骨脂無檢驗(yàn)項(xiàng)目。自《中國藥典》2005 年版開始收載補(bǔ)骨脂的含量測定項(xiàng)，《中國藥典》2010 年版開始收載鹽補(bǔ)骨脂含量測定項(xiàng)。孟祥松等[11]對市售40 批補(bǔ)骨脂按《中國藥典》2010 年版標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，結(jié)果39 批樣品含量不合格。

《中國藥典》2020 年版一部“補(bǔ)骨脂”項(xiàng)下的含量測定方法為高效液相色譜法，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為對照品，供試品經(jīng)索氏提取后測定，按干燥品計(jì)算，含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總量不得少于0.70%。通過研究發(fā)現(xiàn)，該方法存在以下幾個(gè)問題：1）采用的流動(dòng)相為甲醇-水系統(tǒng)，在此系統(tǒng)下補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷等苷類成分在色譜柱上不能被分離。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相改為甲醇-0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)能很好地分離補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，為進(jìn)一步研究補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷與苷元之間的轉(zhuǎn)化提供了參考。2）供試品溶液制備時(shí)采用的是索氏提取、甲醇加熱回流2 h的方法，含量測定的限度為含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總量不得少于0.70%，而《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010 年版采用50%甲醇超聲提取的方式，限度為含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總量不得少于1.6%[12]，差異較大。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在50%甲醇超聲的條件下可以促使補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷向補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素轉(zhuǎn)化，所以測定的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總量較高。

為了進(jìn)一步證實(shí)這種轉(zhuǎn)化，本課題組考察了鹽酸濃度、提取時(shí)間和提取方式，結(jié)果表明，在加入鹽酸-甲醇（1∶4）混合溶液50 mL、加熱回流1 h的條件下，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷先轉(zhuǎn)化成中間體，再由中間體基本轉(zhuǎn)化成補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素，水解完全后與未水解供試品中4個(gè)成分含量總和差異不大。

經(jīng)研究認(rèn)為，主要是測定方法影響了補(bǔ)骨脂的含量測定結(jié)果。因此，建議《中國藥典》2020 年版（一部）“補(bǔ)骨脂”項(xiàng)下含量測定方法中，流動(dòng)相改為甲醇-0.4%磷酸水溶液（42∶58）；供試品溶液的制備方法改為取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定，置回流瓶中，加入鹽酸-甲醇（1∶4）混合溶液50 mL，加熱回流1 h，迅速冷卻至室溫，濾至100 mL 量瓶中，用適量甲醇洗滌容器和濾紙，洗液并入同一量瓶中并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按照此法，本課題組重新測定90 批補(bǔ)骨脂藥材的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的總和為1.69%～2.64%，均高于0.70%。

3 補(bǔ)骨脂儲(chǔ)存過程中的成分轉(zhuǎn)化

根據(jù)本課題組調(diào)研結(jié)果，補(bǔ)骨脂新貨不合格率較高，但儲(chǔ)存一定年限后合格率提高，因此對其儲(chǔ)存條件和時(shí)限進(jìn)行了考察。

首先考察了補(bǔ)骨脂在儲(chǔ)存過程中的溫度和濕度，這2 個(gè)因素通常對中藥材的質(zhì)量影響較大，通過影響因素試驗(yàn)放大溫度和濕度在儲(chǔ)存過程中對補(bǔ)骨脂的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存溫度對樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的含量無影響；但在高濕的環(huán)境下，補(bǔ)骨脂粉碎樣品分別放置0、5、10、20 d 后，補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷含量逐漸降低，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量逐漸升高。因此，通過影響因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濕度對補(bǔ)骨脂中指標(biāo)化合物的含量有較大的影響。

其次，通過高濕試驗(yàn)結(jié)果推測這個(gè)過程是酶促反應(yīng)。在高濕試驗(yàn)中加入酵母菌發(fā)酵，可明顯加速補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。為充分證明這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，又加入單一β-葡萄糖糖苷酶和水的對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，噴灑β-葡萄糖糖苷酶的補(bǔ)骨脂藥材粉末中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量明顯高于噴灑水的藥材粉末，而補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的含量低于噴灑水的藥材粉末。綜合上述結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷在β-葡萄糖糖苷酶的作用下直接轉(zhuǎn)化成補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素。

同時(shí)，本課題組考察了儲(chǔ)存過程中溫度和濕度對鹽補(bǔ)骨脂的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的儲(chǔ)存溫度和濕度對樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的含量均無影響。但在高濕試驗(yàn)中，噴灑β-葡萄糖糖苷酶可明顯加速補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。說明鹽補(bǔ)骨脂在炒制的過程中破壞了植物體內(nèi)含有的轉(zhuǎn)化酶，所以鹽補(bǔ)骨脂不存在放置后“越陳越好”的說法。

由此可見，補(bǔ)骨脂藥材在自身所含酶的催化下，緩慢地將補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷轉(zhuǎn)化為補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素，通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)過程最長可達(dá)7年。

4 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)與補(bǔ)骨脂“越陳越好”“越癟越好”誤區(qū)的關(guān)聯(lián)分析

近年來，因需要符合《中國藥典》2020 年版關(guān)于補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量的限度，供貨商增加補(bǔ)骨脂存儲(chǔ)年限，這給補(bǔ)骨脂藥材的使用帶來了一定的安全隱患。實(shí)際在《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)下，補(bǔ)骨脂藥材“越陳越好”是由于藥材在存儲(chǔ)過程中苷轉(zhuǎn)化為苷元所致。此外，民間還有一個(gè)說法是“越癟越好”。通過本課題組研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素主要分布在皮內(nèi)，癟的補(bǔ)骨脂藥材皮占比較高，導(dǎo)致越癟的補(bǔ)骨脂藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的相對含量越高。補(bǔ)骨脂藥材在歷代本草中均未見“越陳越好”和“越癟越好”的記載，地方炮制規(guī)范中只有“藥材以顆粒飽滿、黑褐色者為佳”的表述，但現(xiàn)在中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)將補(bǔ)骨脂藥材放置3～7 年后出售，藥材的顏色在放置的過程中會(huì)發(fā)生變化，由黑褐色變?yōu)闇\褐色，與傳統(tǒng)描述不符合?！霸桨T越好”與傳統(tǒng)認(rèn)為的“藥材以顆粒飽滿者為佳”也不符合。

因此，“越陳越好”和“越癟越好”的說法可能與《中國藥典》2020 年版檢查標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，并不能反映補(bǔ)骨脂藥材的質(zhì)量。

5 補(bǔ)骨脂藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探析

補(bǔ)骨脂貯藏過程中，體內(nèi)苷類成分在酶的作用下轉(zhuǎn)化為苷元和糖類成分，為其萌發(fā)存儲(chǔ)能量，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，因此不能只測定苷元成分而不考慮苷類成分。本課題組測定了243 批補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素4 個(gè)成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不合格的樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量較低，但相應(yīng)的補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷含量較高，所有批次的補(bǔ)骨脂樣品中，4 個(gè)成分總量基本維持不變，為2.1%～4.5%。

6 小結(jié)

補(bǔ)骨脂藥材在儲(chǔ)存過程中存在自身體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，因此，在衡量補(bǔ)骨脂藥材質(zhì)量時(shí)，要充分考慮其所含成分的動(dòng)態(tài)變化，并基于這種動(dòng)態(tài)變化制定出更加合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期達(dá)到準(zhǔn)確反映藥材質(zhì)量的目的，同時(shí)也為其他中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供研究思路和科學(xué)依據(jù)。