糞菌移植與中藥大黃治療高脂血癥性急性胰腺炎大鼠模型的效果比較

羅旭娟，白 雪，李增暉，劉 帆，唐 浩，李若欣，楊國棟

1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院a.消化內(nèi)科，b.醫(yī)學(xué)影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室放射科，四川 南充 637000；2川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000

近年來，高脂血癥性急性胰腺炎（hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP）的發(fā)病率逐年上升，目前約占急性胰腺炎總數(shù)的25.6%，已成為中國急性胰腺炎發(fā)病的第三大病因，發(fā)病率僅次于酒精性胰腺炎與膽源性胰腺炎，遠(yuǎn)高于西方國家，且發(fā)病年齡較輕，易并發(fā)糖尿病、脂肪肝，更易轉(zhuǎn)為重度急性胰腺炎，并發(fā)癥及病死率更高［1］。如何有效控制HLAP向重度急性胰腺炎轉(zhuǎn)化，有效控制感染并發(fā)癥的發(fā)生，改善預(yù)后，防止復(fù)發(fā)，成為HLAP治療的關(guān)鍵。目前認(rèn)為，甘油三酯（TG）＞11.3 mmol/L是誘發(fā)胰腺炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，快速將TG降至5.65 mmol/L以下，可有效防止HLAP病情進(jìn)展。臨床上將血液濾過、胰島素、降脂藥物、肝素作為快速降脂的主要手段，但易復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)期療效欠佳。

HLAP患者常伴有腸道屏障功能受損和菌群移位，是并發(fā)感染并發(fā)癥的基礎(chǔ)。腸道菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變，不僅與胰腺炎炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還與高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)［2－5］。Vrieze等［6］予以代謝綜合征患者進(jìn)行糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）治療，發(fā)現(xiàn)接受糞便捐獻(xiàn)組患者的胰島素敏感性和產(chǎn)丁酸腸道菌群水平顯著升高，推測FMT可以作為治療代謝相關(guān)性疾病的潛在策略。故本研究擬對HLAP進(jìn)行FMT治療，以探索FMT是否可通過降低HLAP血脂來減少炎癥反應(yīng)，改善預(yù)后。中藥大黃是急性胰腺炎患者常用中藥之一，早期應(yīng)用可明顯減輕HLAP的臨床癥狀，抑制炎癥，改善血脂代謝，減少HLAP并發(fā)癥的發(fā)生率［7－8］。故本文以中藥大黃為對照，以探索FMT對HLAP的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 臺(tái)式高速微量離心機(jī)（美國賽洛捷克SCILOGEX）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國賽洛捷克SCILOGEX）、全自動(dòng)生化分析儀（邁瑞）、酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）、洗板機(jī)（芬蘭Thermo Lab

systems）、微量高速離心機(jī)（型號：TG16W）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號：GNP－9080）；ELISA試劑盒購自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量220～280 g，購自川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2018－18，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號：SYXK（川）2018－076］，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組：假手術(shù)組、模型組、大黃組、糞菌組，每組各18只，各組再進(jìn)一步分為術(shù)后6 h、24 h及36 h亞組，每亞組各6只。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，可自由飲水，造模前2 h禁水。假手術(shù)組、模型組、大黃組、糞菌組均以高脂飼料（基礎(chǔ)飼料82.6%＋豬油10%＋膽固醇2%＋膽酸鈉0.2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%＋蔗糖5%）喂養(yǎng)8周，在大鼠高脂飼料喂養(yǎng)前后均抽血化驗(yàn)血清總膽固醇（TC）、TG水平，喂養(yǎng)后TC及TG較喂養(yǎng)前顯著增高，則表明高脂血癥大鼠造模成功。造模成功后，模型組、大黃組、糞菌組采用5%牛黃膽酸鈉逆行胰膽管注射的方法構(gòu)建急性胰腺炎模型［9］。假手術(shù)組僅在開腹后提出十二指腸并輕輕翻動(dòng)胰腺后即關(guān)腹。急性胰腺炎造模成功后，將大鼠取俯臥位，向上輕抬尾巴，將2 mm直徑的硅膠灌腸管末端涂抹石蠟油后經(jīng)肛門輕輕插入，深度4～5 cm，倒立大鼠，緩慢注入各組所需灌腸液2 mL（假手術(shù)組、模型組采用生理鹽水；大黃組采用生大黃12 g＋50 mL生理鹽水配置灌腸液；糞菌組采用健康大鼠新鮮糞菌液作為灌腸液），停留10 s后緩慢拔出硅膠灌腸管，保持大鼠倒立1 min后放回籠中。

1.2.3 標(biāo)本采集 各組大鼠分別于術(shù)后6 h、24 h、36 h麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈進(jìn)行采血，分離血清后保存于－80℃冰箱；采血后采用頸椎脫臼法處死大鼠，并快速取出大鼠胰腺、末端回腸組織，4%多聚甲醛固定后用于后續(xù)測定。

1.2.4 組織病理學(xué) 取各組大鼠胰腺、末端回腸組織，置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。各組于光學(xué)顯微鏡下閱片評分，其中采用改良Schmidt胰腺組織評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［10］和Chiu’s小腸組織損傷評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［11］作為參考。

1.2.5 血清淀粉酶及生化相關(guān)指標(biāo) 血清淀粉酶、AST、ALT、TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）采用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 炎癥因子檢測 采用ELISA法測定造模6 h、24 h、36 h大鼠血清IL－6、TNFα水平，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 腸道通透性檢測 采用ELISA法測定造模6 h、24 h、36 h大鼠血清內(nèi)毒素水平，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)或Tamhane T2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，多組間比較采用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺、小腸（回腸）組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組胰腺、小腸組織均無顯著改變。模型組大鼠胰腺鏡下可見充血、腺泡結(jié)構(gòu)破壞、小葉間隔增寬，胰腺組織可見溶解壞死，中性粒細(xì)胞浸潤。大黃組6 h胰腺組織病理評分與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在24 h、36 h胰腺組織病理評分均較假手術(shù)組顯著升高（P值均＜0.05）；糞菌組胰腺組織病理評分在6 h、36 h較假手術(shù)組均無明顯差異（P值均＞0.05），而在24 h顯著低于模型組（P＜0.05）（圖1，表1）。模型組大鼠回腸末端組織腸黏膜層水腫，小腸絨毛稀少、脫落、斷裂明顯；上皮細(xì)胞明顯脫落；絨毛固有層結(jié)締組織松散，中性粒細(xì)胞浸潤明顯，腺體變淺，數(shù)量顯著減少。大黃組回腸末端組織評分在6 h、24 h與假手術(shù)組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），但在36 h時(shí)較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05），且與模型組無顯著差異（P＞0.05）；糞菌組回腸末端組織評分在6 h、24 h、36 h均較假手術(shù)組無顯著升高（P值均＞0.05）（圖2，表2）。

表1 各組不同時(shí)間段的大鼠胰腺組織病理評分Table 1 Comparison of pathological scores of pancreatic tissue

表2 各組不同時(shí)間段的大鼠回腸末端組織病理評分Table 2 Comparison of pathological scores of terminal ileum tissue

圖1 各組大鼠術(shù)后36 h的胰腺組織病理學(xué)改變（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of pancreatic histopathology at 36 h（HE，×200）

圖2 各組大鼠術(shù)后36 h的回腸末端組織病理學(xué)改變（HE染色，×200）Figure 2 Histological comparison of terminal ileum at 36 h（HE，×200）

2.2 血清淀粉酶水平比較 模型組、大黃組和糞菌組在6 h、24 h時(shí)，血清淀粉酶水平均明顯高于假手術(shù)組（P值均＜0.05）；在36 h時(shí)，大黃組與糞菌組血清淀粉酶水平均較模型組顯著降低（P值均＜0.05），且與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）（表3）。

表3 各組不同時(shí)間段的大鼠血清淀粉酶Table 3 Comparison of serum amylase

2.3 生化相關(guān)指標(biāo)比較

2.3.1 血清ALT 模型組6 h、24 h、36 h ALT水平均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05）；大黃組6 h、36 h ALT水平較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05），但36 h較模型組明顯下降（P＜0.05）；糞菌組各時(shí)間段ALT水平均較假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），而較模型組顯著降低（P值均＜0.05）（表4）。

2.3.2 血清AST 模型組24 h、36 h AST水平均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05）；大黃組24 h、36 h AST水平較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05），但在24 h時(shí)顯著低于模型組（P＜0.05）；糞菌組AST水平在24 h、36 h時(shí)均較模型組顯著降低（P值均＜0.05），且在36 h時(shí)明顯低于大黃組（P＜0.05）（表4）。

2.3.3 血清TC 模型組、大黃組和糞菌組6 h、24 h、36 h TC水平均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05）；但大黃組24 h、36 h與糞菌組6 h、36 h TC水平較模型組顯著降低（P值均＜0.05）（表4）。

2.3.4 血清TG 模型組、大黃組和糞菌組6 h、24 h、36 h TG水平均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05）；糞菌組在6 h、24 h TG水平較模型組顯著降低（P值均＜0.05）（表4）。

2.3.5 血清HDL－C 模型組、大黃組各時(shí)間段HDLC水平與假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）；糞菌組各時(shí)間段HDL－C水平均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05），且在24 h、36 h時(shí)明顯高于大黃組（P值均＜0.05）（表4）。

2.3.6 血清LDL－C 模型組、大黃組各時(shí)間段LDLC水平均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05），大黃組6 h時(shí)LDL－C水平低于模型組（P＜0.05）；糞菌組各時(shí)間段LDL－C水平與假手術(shù)組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），但均較模型組明顯降低（P＜0.05）（表4）。

表4 各組不同時(shí)間段的大鼠生化相關(guān)指標(biāo)比較Table 4 Comparison of biochemical indexes in different time

2.4 炎癥因子水平比較 IL－6檢測結(jié)果顯示，模型組和大黃組在6 h、24 h、36 h均較假手術(shù)組顯著增高（P值均＜0.05）；大黃組在6 h和36 h時(shí)IL－6水平較模型組顯著降低（P值均＜0.05）；糞菌組與假手術(shù)組各時(shí)間段IL－6水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），但糞菌組各時(shí)間段IL－6水平均顯著低于大黃組（P值均＜0.05）（表5）。

TNFα檢測結(jié)果顯示，模型組和大黃組在6 h、24 h、36 h時(shí)均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）；大黃組在36 h時(shí)TNFα水平較模型組顯著降低（P＜0.05）；糞菌組TNFα水平在各時(shí)間段與假手術(shù)組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），但在6 h時(shí)顯著低于大黃組（P＜0.05）（表5）。

表5 各組不同時(shí)間段的大鼠血清炎癥因子水平比較Table 5 Comparison of serum inflammatory factors in different time

2.5 血清內(nèi)毒素比較 與假手術(shù)組相比，模型組和大黃組6 h、24 h、36 h的血清內(nèi)毒素水平均顯著增高（P值均＜0.05），而糞菌組僅在36 h時(shí)顯著增高（P＜0.05）；大黃組和糞菌組在6 h、24 h、36 h時(shí)內(nèi)毒素水平均顯著低于模型組（P值均＜0.05），且糞菌組在6 h時(shí)內(nèi)毒素水平顯著低于大黃組（P＜0.05）（表6）。

表6 各組不同時(shí)間段的大鼠血清內(nèi)毒素水平比較Table 6 Comparison of serum endotoxin

3 討論

HLAP主要是血脂代謝異常引起的一種急性胰腺炎，而急性胰腺炎又能加重機(jī)體的血脂代謝異常，造成惡性循環(huán)［7，12］。高甘油三酯血癥引起急性胰腺炎主要是由于TG水解時(shí)產(chǎn)生大量游離脂肪酸，導(dǎo)致胰腺腺泡結(jié)構(gòu)受損，胰酶異常激活，胰腺微循環(huán)障礙所致。高甘油三酯血癥主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性主要指遺傳性脂質(zhì)代謝障礙，繼發(fā)性的病因主要包括肥胖、糖尿病、藥物等［13］?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，腸道菌群失調(diào)與肥胖和血脂代謝異常密切相關(guān)。Ley等［14］通過采用16sRNA基因測序的方法分析肥胖小鼠及12例肥胖患者糞便中的細(xì)菌組成，發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠與肥胖患者體內(nèi)擬桿菌門減少，厚壁菌門增加，予以低脂飲食后，擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門減少。Turnbaugh等［15］將瘦型小鼠與肥胖小鼠的腸道菌群分別移植到無菌小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示移植肥胖小鼠腸道菌群的無菌小鼠更容易從食物中吸取能量，體質(zhì)量明顯增加，提示腸道菌群紊亂與肥胖和能量代謝相關(guān)，F(xiàn)MT或可作為治療肥胖和血脂代謝異常的方法。在對急性胰腺炎的研究［16］中發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂可導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損，引起感染并發(fā)癥發(fā)生率增加，影響患者預(yù)后。而中藥大黃，作為臨床治療急性胰腺炎常用中藥之一，具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)排除腸內(nèi)毒素、移植腸道細(xì)菌移位、保護(hù)腸道黏膜屏障功能的作用。大黃在治療急性胰腺炎時(shí)，可使大腸桿菌豐度降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量上升，減少菌群移位；在治療HLAP時(shí)可改善血脂代謝，降低并發(fā)癥發(fā)生率［7－8］。故本研究通過采用FMT與中藥大黃的療效對比分析，探討FMT對HLAP血脂代謝及炎癥的影響，以期為HLAP的治療提供新的理論依據(jù)。

FMT是指將健康供體的糞便微生物移植到患者體內(nèi)，重建腸道菌群，以達(dá)到治療疾病的目的。FMT在炎癥性腸病、難辨梭狀芽孢桿菌感染性腹瀉治療方面的報(bào)道居多，但在急性胰腺炎尤其是在HLAP中的研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MT和中藥大黃均能使HLAP大鼠胰腺及回腸末端組織病理學(xué)損傷得到改善，糞菌組在36 h時(shí)的療效優(yōu)于大黃組；糞菌組各時(shí)間段IL－6水平均顯著低于大黃組，在6 h時(shí)TNFα水平顯著低于大黃組；腸道通透性指標(biāo)血清內(nèi)毒素結(jié)果顯示，F(xiàn)MT與中藥大黃均能降低HLAP血清內(nèi)毒素水平，且糞菌組在6 h時(shí)顯著低于大黃組。以上結(jié)果提示，F(xiàn)MT與中藥大黃均能有效改善HLAP炎癥反應(yīng)，降低腸道通透性，緩解HLAP病情，且FMT作用時(shí)間更快，對胰腺及回腸末段組織損傷改善更為明顯。

FMT作為代謝綜合征新的治療方向，在治療胰島素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪性肝病方面均有相關(guān)報(bào)道。既往研究［17－19］結(jié)果顯示，F(xiàn)MT能使非酒精性脂肪性肝病大鼠的血脂及肝酶顯著降低，肝臟脂肪變性程度減輕，但在臨床研究中并未得出陽性結(jié)果。本研究通過對HLAP大鼠模型進(jìn)行FMT治療，在與單用中藥大黃的對比分析中發(fā)現(xiàn)，糞菌組與大黃組均能改善大鼠肝酶水平，糞菌組大鼠血清ALT較模型組各時(shí)間段均明顯降低，AST水平在24 h、36 h較模型組顯著降低；大黃組僅在36 h時(shí)ALT水平較模型組顯著降低，24 h時(shí)AST水平較模型組顯著降低。與模型組相比，F(xiàn)MT在6 h時(shí)即可顯著降低大鼠TG水平，但大黃組未見明顯療效；大黃組在6 h時(shí)可顯著降低LDL－C水平，但在24 h、36 h時(shí)與模型組比無顯著差異，而糞菌組在各時(shí)間段均可降低LDL－C并升高HDL－C，表明FMT與中藥大黃均能改善血脂代謝，但就本研究結(jié)果提示，F(xiàn)MT療效持續(xù)時(shí)間更長。

綜上，HLAP大鼠炎癥加重，腸道通透性增加，F(xiàn)MT不僅能改善炎癥反應(yīng)和腸道通透性，還能改善血脂代謝，緩解病情，可作為HLAP新的治療手段。但本研究作用時(shí)間較短，最長僅36 h，無法證實(shí)FMT是否能夠預(yù)防HLAP的復(fù)發(fā)，且缺乏腸道菌群測序及相關(guān)機(jī)制研究，故尚不能明確FMT改善HLAP的具體原因，需更多更深入的實(shí)驗(yàn)加以探究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年3月27日經(jīng)由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號：NSMC倫理動(dòng)物審［2021］105號，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：羅旭娟負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)；羅旭娟、白雪負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文并最后定稿；白雪、李增暉、唐浩、李若欣負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，分析數(shù)據(jù)；劉帆負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理；楊國棟負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。