可利霉素對胰腺癌細胞生物學功能的影響

白麗娜，劉 穎，唐春曉，樸紅心，林貞花，楊萬山，金愛花，2b

1延邊大學醫(yī)學院腫瘤研究中心，吉林 延吉 133000；2延邊大學附屬醫(yī)院a.感染性疾病科，b.消化內(nèi)科，吉林 延吉 133000

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其在我國發(fā)病率上升至第9位，死亡率位居第6位，5年生存率僅為7.2%［1－2］。由于PC發(fā)病隱匿和早期診斷困難等因素，約80%的患者確診時已為晚期，錯過最佳手術機會［3－4］。對于無法手術治療及術后轉(zhuǎn)移的晚期患者，化療是主要的治療方式，但化療引起的不良反應導致患者生存質(zhì)量嚴重下降［5］。因此，尋找具有良好抗腫瘤活性、較強組織滲透性和毒副作用小的抗PC藥物是臨床亟待解決的重要問題。

可利霉素（Carrimycin）是我國首次利用合成生物學技術自主研發(fā)的基因工程藥物，擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，于2019年6月批準上市［6］。最新研究［7］發(fā)現(xiàn)，可利霉素中的主要成分異戊螺旋霉素Ⅰ可抑制肝癌細胞的腫瘤生長，并初步揭示其通過下調(diào)細胞程序性死亡配體1表達抑制肝癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子機制。Liang等［8］的研究結(jié)果也顯示，可利霉素在體內(nèi)和體外均能抑制口腔鱗狀細胞癌的細胞生物學活性。但其在PC惡性進展中是否發(fā)揮類似的抗癌作用仍有待闡釋。為此，本研究旨在探究可利霉素對PC細胞生物學功能的影響，從而為其在PC中的治療提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 PC細胞株MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988均由延邊大學腫瘤研究中心提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基（C11330500BT）、胎牛血清（10100147）和胰蛋白酶（25200－072）均購自美國GIBCO公司；可利霉素（國藥準字號：H20190029）購自上海同聯(lián)制藥有限公司；青霉素/鏈霉素（15140－122）購自美國GIBCO公司；超敏ExPlus ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（ZD310A）購自莊盟生物科技有限公司；EdU（5－Ethynyl－2’－deoxyuridine）試劑盒（C10310）購自廣州銳博生物技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（D8371）與四甲基偶氮唑鹽［3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］（M8180）購自北京索萊寶生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（CW0014）購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗上皮鈣黏素（E－cadherin）（ab15148）抗體購自美國Abcam公司；兔抗鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）（sc－271977）購自美國Santa－Cruz公司；小鼠抗波形蛋白（Vimentin）（V6389）抗體購自美國Millipore公司；小鼠β－肌動蛋白（CW0096M）抗體購自康為世紀生物科技有限公司；細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（P21）（28248－1－AP）購自美國Proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔二抗（ZB－2301）和HRP標記的山羊抗小鼠二抗（ZB－2305）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗兔熒光二抗Alexa Fluor 488（A－11034）和山羊抗小鼠熒光二抗Alexa Fluor 568（A－11004）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（FormaTM系列Ⅱ3110）購自美國Thermo公司；臺式微量冷凍離心機（CT15RE）購自日本日立公司；全波長多功能酶標儀（Spark）購自瑞士Tecan公司；光學倒置顯微鏡（IX71）購自日本Olympus公司；熒光正置顯微鏡（BX53）購自日本Olympus公司；垂直電泳儀（PowerPac系列）購自美國BioRad公司；電轉(zhuǎn)儀（全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)1704150）購自美國BioRad公司；ChemiDoc成像系統(tǒng)（1708280）購自美國BioRad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988細胞培養(yǎng)在含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，當細胞長至90%時，以1∶3的比例進行傳代，待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT實驗 將細胞常規(guī)消化、離心后以MIA PaCa－2每孔5×103個/100μL、BxPC－3每孔2×103個/100μL、Panc－1每孔3×103個/100μL和PATU 8988每孔5×103個/100μL的細胞數(shù)種植于96孔板中，每孔補充培養(yǎng)基至200μL，待細胞貼壁后，加入濃度為0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素，每個藥物濃度設置5個平行復孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入20μL（5 mg/mL）MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，每孔內(nèi)加入100μL的DMSO，震蕩10 min之后，使用全波長酶標儀于570 nm波長測定各培養(yǎng)孔的吸光值（A）。根據(jù)公式計算細胞生存率（%）＝（可利霉素處理組吸光值/對照組吸光值）×100%，并繪制細胞增殖曲線計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.2.3 細胞分組 取對數(shù)生長期MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988細胞加入不同濃度可利霉素組，進行MTT實驗篩選細胞株。依據(jù)MTT實驗結(jié)果選擇BxPC－3和MIA PaCa2兩種細胞系在4、8和16μmol/L用藥濃度和48 h用藥時間進行后續(xù)實驗。

1.2.4 EdU細胞增殖檢測實驗 將生長對數(shù)期細胞常規(guī)消化、離心后以MIA PaCa－2每孔1×104個/100μL、BxPC－3每孔5×103個/100μL的細胞數(shù)種植于96孔板中，待細胞貼壁后分別加入0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞48 h，然后每孔加入100μL 50μmol/L EdU，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。PBS洗滌細胞2次，加入50μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，每孔加入50μL 2 mg/mL甘氨酸溶液搖床孵育5 min，PBS洗滌5 min，再加入100μL 0.5%Triton X－100搖床孵育10 min。再次洗滌細胞后每孔加入100μL 1×Apollo染色反應液后室溫避光搖床孵育30 min，棄染色反應液。洗滌細胞后每孔加入1×Hoechst33342反應液100μL，室溫避光孵育30 min。再次洗滌后每孔加入100μL PBS，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 集落形成實驗 常規(guī)消化細胞后接種于6孔板，每孔接種1000個細胞，分別加入濃度為0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞繼續(xù)培養(yǎng)2周，當細胞生長至肉眼可見的細胞集落時，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，預冷PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，蘇木素染色30 min，棄蘇木素，蒸餾水返藍后于室溫下干燥，計數(shù)每孔集落形成數(shù)目。

1.2.6 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期且生長良好的MIA PaCa－2和BxPC－3細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入濃度為0（對照組）、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞48 h后常規(guī)消化，收集細胞懸液，用預冷PBS洗滌2次，再加入預冷的70%乙醇，4℃固定過夜。次日細胞離心、預冷PBS重懸后，每管加入1.5 mL PI染色液輕輕重懸均勻，37℃水浴鍋中避光孵育30 min后上機檢測。

1.2.7 細胞劃痕愈合實驗 常規(guī)消化細胞并等量接種于6孔板中，細胞密度達到80%時，使用無菌槍頭在單層細胞上垂直劃痕。用PBS清洗漂浮的細胞后，分別加入濃度為0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞，分別培養(yǎng)0、12、24和48 h后觀察并拍照。

1.2.8 免疫蛋白印跡法（Western blot） 用藥處理結(jié)束后，收集細胞，加入裂解液提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白的濃度。各組蛋白取30μg樣本進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后，與一抗在4℃孵育過夜。次日用TBS－T洗膜，TBS－T稀釋二抗，于低速搖床上室溫孵育2 h后，用ECL法顯影、曝光，最后用Image J統(tǒng)計結(jié)果并分析。

1.2.9 免疫熒光染色實驗 將細胞置于6孔板中培養(yǎng)48 h后，依次進行PBS洗滌、多聚甲醛固定、Triton－100透化、胎牛血清封閉后，以1∶100的比例稀釋兔抗Ecadherin抗體、小鼠抗Vimentin抗體。一抗4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌后，以1∶400的比例稀釋山羊抗兔熒光二抗或山羊抗小鼠熒光二抗，室溫避光孵育2 h。PBS洗滌后，滴入含DAPI的封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 本實驗的結(jié)果均采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD－t檢驗。所有實驗均重復3次或3次以上。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 可利霉素抑制PC細胞的增殖活性 為了觀察可利霉素對PC細胞增殖活性的影響，MTT實驗檢測以0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素處理PC細胞MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988于24、48和72 h后細胞的增殖活力，結(jié)果顯示：可利霉素可抑制PC細胞的增殖活性，且隨著藥物濃度的升高和用藥時間的延長，細胞活性逐漸降低，并呈藥物濃度與時間依賴性（P值分別＜0.01、＜0.001、＜0.0001）（圖1）；應用Graphpad Prism 8.0軟件計算得出可利霉素處理PC細胞48 h后MIA PaCa－2細胞的IC50值為6.67μmol/L；BxPC－3細胞的IC50值為5.76μmol/L；Panc－1細胞的IC50值為8.62μmol/L；PATU 8988細胞的IC50值為7.47μmol/L。根據(jù)這一結(jié)果，將選取MIA PaCa－2和BxPC－3細胞，0、4、8和16μmol/L用藥濃度和48 h用藥時間進行后續(xù)實驗。

圖1 MTT法檢測0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素對PC細胞系的細胞增殖活性。Figure 1 Cell viabilityof PC cells treated by Carrimycin for 0，2，4，8 and 16μmol/L was measured by MTT assay

2.2 可利霉素抑制PC細胞的增殖和克隆形成能力 EdU細胞增殖實驗結(jié)果（圖2a）顯示：4、8、16μmol/L可利霉素分別與對照組比較，可顯著降低PC細胞MIA PaCa－2（t值分別為2．378、4．984、18．970，P值分別為＜0.05、＜0.01、＜0.000 1）及BxPC－3（t值分別為4.879、6．089、9．521，P值分別為＜0.01、＜0.001、＜0.000 1）的DNA復制能力；集落形成實驗結(jié)果（圖2b）表明，4、8、16μmol/L可利霉素處理PC細胞14 d后，分別與對照組比較，MIA PaCa－2（t值分別為5．889、11．240、15．840，P值分別為＜0．001、＜0．000 1、＜0.000 1）和BxPC－3（t值分別為6．717、15．800、18．850，P值分別為＜0．001、＜0．000 1、＜0．000 1）細胞的集落形成能力隨著藥物濃度的增加而明顯減少。以上結(jié)果提示，可利霉素能夠抑制PC細胞的增殖能力。

2.3 可利霉素促進PC細胞周期阻滯 通過流式細胞術分析可利霉素是否通過調(diào)控細胞周期抑制PC細胞的增殖，結(jié)果（圖3a）顯示：與對照組比較，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2細胞G1期比例（t值分別為9．071、12．280、19．360，P值均＜0.000 1）及BxPC－3細胞G1期比例（t值分別為3.061、4．962、8．868，P值分別為＜0.05、＜0.01、＜0.000 1）均增加，MIA PaCa－2細胞S期比例（t值分別為2．316、4．165、5．562，P值分別為＜0．05、＜0．01、＜0.001）及BxPC－3細胞S期比例（t值分別為2.424、3．264、5．744，P值分別為＜0.05、＜0.05、＜0.001）均降低。Western blot實驗（圖3b）進一步證實，與對照組比較，周期相關蛋白P21在MIA PaCa－2（t值分別為5．437、6．453、8．799，P值分別為＜0．001、＜0.001、＜0．000 1）和BxPC－3細胞（t值分別為25．13、44．75、52.96，P值均＜0．000 1）中的表達水平隨可利霉素用藥濃度增加而逐漸上調(diào)。上述結(jié)果表明，可利霉素促進G1期細胞周期阻滯、上調(diào)P21表達抑制PC細胞的增殖。

圖3 細胞周期和Western Blot實驗檢測不同濃度的可利霉素對MIA PaCa－2和BxPC－3細胞周期的影響Figure 3 Cell cycle and Western Blot experiments were performed to examine the effects of different concentrations of Carrimycin on the cell cycle of MIA PaCa－2 and BxPC－3 cells

2.4 可利霉素抑制PC細胞的遷移和上皮細胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）進程 劃痕愈合實驗結(jié)果（圖4a、b和表1）顯示，0和4、8、16μmol/L可利霉素處理12、24和48 h PC細胞MIA PaCa－2（P值分別為＜0.05、＜0.01、＜0.001、＜0.000 1）及BxPC－3（P值分別為＜0.05、＜0.001、＜0.000 1）的橫向遷移能力明顯減弱。Western Blot實驗結(jié)果（圖4c）顯示，與對照組比較，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2（t值分別為2．388、4．899、5．819，P值分別＜0.05、＜0.01、＜0.001）及BxPC－3細胞（t值分別為2．533、5．836、6.774，P值分別＜0．05、＜0．001、＜0．001）中上皮標志物E－cadherin的表達明顯上調(diào)，同樣地，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2（t值分別為12．440、14．830、16．800，P值均＜0．000 1）及BxPC－3細胞（t值分別為5．039、5.893、7.725，P值分別為＜0．01、＜0．001、＜0．000 1）中間質(zhì)標志物Snail的表達水平顯著下調(diào)，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2（t值分別為3．105、7．752、11．200，P值分別為＜0．05、＜0．000 1、＜0．000 1）及BxPC－3細胞（t值分別為2.555、4．883、9．153，P值分別為＜0．05、＜0．01、＜0．000 1）中間質(zhì)標志物Vimentin的表達水平也顯著下調(diào)；與上述結(jié)果一致，免疫熒光結(jié)果（圖4d）進一步亦證實，可利霉素處理組的E－cadherin熒光信號明顯增強，而Vimentin的熒光信號則明顯減弱。這些結(jié)果表明，可利霉素通過EMT進程抑制PC細胞的遷移。

圖4 不同濃度的可利霉素對MIA PaCa－2和BxPC－3細胞遷移及EMT進程的影響Figure 4 Effects of different concentrations of Carrimycin on migration and EMT progression of MIA PaCa－2 and BxPC－3 cells

表1 不同濃度的可利霉素對MIA PaCa－2細胞和BxPC－3細胞遷移的影響Table 1 Effect of carrimycin at different concentrations on the migration of MIA PaCa－2 cells and BxPC－3 cells migration

3 討論

在腫瘤治療過程中，隨著抗癌藥物的廣泛應用，腫瘤細胞對其產(chǎn)生不可忽視的耐藥性，致使人們對不同藥物重新定位，挖掘潛在的臨床價值。令人鼓舞的是，許多臨床批準的非癌癥藥物在生物學實驗中甚至臨床上都顯示出較好的抗腫瘤活性，其中關于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的相關研究較多。例如，大環(huán)內(nèi)酯類藥物雷帕霉素能抑制PC、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力，并能促進細胞周期阻滯，誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤形成［9］。有研究［10－12］報道顯示，大環(huán)內(nèi)酯類化合物埃博霉素與微管蛋白結(jié)合，影響腫瘤細胞的有絲分裂過程，進而抑制腫瘤生長。可利霉素作為一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素新藥，不僅具有良好的抗菌效果，還具有抑制腫瘤細胞增殖及其轉(zhuǎn)移的作用［13］。后續(xù)研究［7］發(fā)現(xiàn)，可利霉素可通過抑制PI3K/mTOR信號通路，降低IL－6和IL－8水平，抑制腫瘤細胞細胞程序性死亡－配體1的表達，從而抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞特異性活化，繼而發(fā)揮抑癌作用，還具備誘導M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化的功能。但其具體抑癌機制尚不明確。為此，本研究主要探討大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可利霉素對PC細胞體外增殖及轉(zhuǎn)移能力是否有抑制作用，并進一步研究其可能的機制，為今后治療PC提供新思路。

腫瘤細胞異常增殖是促進癌細胞發(fā)生發(fā)展進程中的重要因素，因此，抑制腫瘤細胞增殖能有效調(diào)控癌細胞發(fā)生發(fā)展過程。本研究利用濃度和時間梯度可利霉素處理PC細胞，觀測可利霉素對PC細胞活力、增殖及細胞周期的影響。研究結(jié)果顯示，可利霉素隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長能有效抑制PC細胞的體外增殖、集落形成能力及DNA復制能力并誘導PC細胞周期阻滯于G1期，進一步的Western Blot實驗證實了細胞周期相關標志蛋白P21的表達隨可利霉素用藥濃度增加而逐漸上調(diào)，上述結(jié)果均可表明可利霉素能夠抑制PC細胞的增殖能力。這與Jin等［7］和Liang等［8］的研究結(jié)果相一致。

有報道［14］證實EMT進程是參與胰腺炎向PC轉(zhuǎn)變以及PC轉(zhuǎn)移的重要機制。當腫瘤細胞EMT進程得到促進時，下調(diào)上皮標志物E－cadherin蛋白和過量表達間質(zhì)標志物Snail與Vimentin蛋白，導致腫瘤細胞的運動能力變強，進而在宏觀上表現(xiàn)為癌癥全身轉(zhuǎn)移擴散，從而加劇了腫瘤的治療難度［15－17］。因此，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，抑制或逆轉(zhuǎn)EMT進程對幫助腫瘤患者抑制疾病和治療疾病等均起著重要作用。于是通過劃痕愈合實驗、Western Blot和免疫熒光實驗研究可利霉素對PC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，可利霉素呈濃度和時間依賴性的方式抑制PC細胞的遷移，同時上調(diào)上皮標志物E－cadherin的表達，下調(diào)間質(zhì)標志物Snail和Vimentin的表達水平，提示可利霉素可通過逆轉(zhuǎn)EMT進程抑制PC細胞的遷移能力。而PC的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因參與、多因素影響的多步驟復雜過程［18］，對于EMT進程在侵襲轉(zhuǎn)移中的機制及可能存在的其他與轉(zhuǎn)移相關的信號通路還有待進一步發(fā)掘和探討。

綜上所述，可利霉素可通過有效抑制PC細胞的增殖和遷移等生物學進程發(fā)揮其抗腫瘤的生物學活性。并且深入探究可利霉素在PC發(fā)生與發(fā)展過程中的作用及機制，可為PC的治療進一步提供基礎研究和新的希望，但可利霉素抑制PC細胞可能涉及多條信號通路，其具體的作用機制和臨床應用仍需更深入地研究探討。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：白麗娜負責實驗設計、實施、論文撰寫及數(shù)據(jù)分析；劉穎、唐春曉負責實驗設計、實施及論文修改；楊萬山負責實驗設計與論文修改；金愛花、樸紅心、林貞花負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。