胰腺癌動物模型的比較與選擇

延張勵，許小凡，辛嘉萁，張 紅，3

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西咸新區(qū) 712046；2慕尼黑工業(yè)大學(xué)伊莎河右岸醫(yī)院胰腺病研究所，德國 慕尼黑 81675；3陜西省免疫炎癥相關(guān)疾病中醫(yī)藥防治國際聯(lián)合研究中心，陜西 西咸新區(qū) 712046

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，起病隱匿、惡性程度高、化療反應(yīng)差、疾病進展快，加之胰腺的解剖位置特殊、腫瘤切除率低，因此PC極易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差［1］。當前急需尋找高效的治療手段遏制PC的進展，而開展大量臨床和基礎(chǔ)研究以明確PC的發(fā)病機制是提高其臨床療效的重要前提。目前，用于PC相關(guān)基礎(chǔ)研究的動物模型主要分為化學(xué)藥物誘導(dǎo)、移植瘤和基因工程三類。本文將對各種常用的PC動物模型進行比較，旨在為PC研究中動物模型的選擇提供一定的依據(jù)。

1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型

化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型是通過化學(xué)致癌劑使細胞發(fā)生惡變從而建立PC模型［2］，常用的化學(xué)致癌劑有：N－亞硝基雙（2－氧丙基）胺［N－nitrosobis（2－oxopropyl）amine，BOP］、7，1 2－二甲基苯并蒽（7，1 2－dimethylbenzanthracene，DMBA）等。

1.1 N－亞硝基雙（2－氧丙基）胺（BOP）誘導(dǎo) BOP是二正丙基亞硝胺（di－N－propyl nitrosamine）的一種β－代謝物，多種研究顯示，BOP具有“廣譜”致癌作用，但其致癌作用機制尚未完全清楚［3］。

衛(wèi)積書等［3］采用BOP（20 mg/kg，1次/周，4周）對敘利亞倉鼠進行腹壁皮下注射，20周時倉鼠總體胰腺成瘤率僅為17.64%，且發(fā)現(xiàn)實驗鼠均不同程度產(chǎn)生了肝硬化，說明高劑量BOP的副作用較大，容易誘發(fā)其他器官病變，且PC的誘發(fā)率并不夠高。而馬青松等［4］在倉鼠皮下注射低劑量BOP（10 mg/kg，1次/周，7周），結(jié)果發(fā)現(xiàn)25周后總成瘤率為81.3%，部分實驗鼠出現(xiàn)了黃疸、體質(zhì)量減輕及遠處轉(zhuǎn)移等PC相關(guān)臨床表現(xiàn)。隨后大量實驗［5－6］表明，10 mg/kg BOP是目前誘導(dǎo)PC動物模型較為合適的給藥劑量，但適宜的給藥時間尚未形成統(tǒng)一共識。BOP皮下注射誘導(dǎo)PC操作較為簡單，但由于其廣譜致癌性，易導(dǎo)致并發(fā)其他器官的病變。

1.2 DMBA誘導(dǎo) DMBA具有強力致癌作用，其在生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的生成物可以與DNA共價結(jié)合，致使DNA損傷與染色體畸變，從而誘發(fā)癌基因和抑癌基因突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［7］。

夏蜀珺［8］采用DMBA（5 mg）晶體縫合入SD大鼠胰腺被膜下，2周后18.8%實驗鼠鏡下可觀察到胰腺上皮內(nèi)瘤變，37.5%實驗鼠發(fā)生了PC，1個月后PC發(fā)生率約76.5%，該方法造模時間較短，且高效地呈現(xiàn)了不同時期的PC病變。

DMBA誘導(dǎo)的PC不引起其他臟器腫瘤，且具有較高的基因突變發(fā)生率［9］，與人類PC的病理進展過程相似，造?？梢酝暾^察到各個階段PC病變發(fā)展，但手術(shù)操作較為復(fù)雜。目前造模常用劑量為7～9 mg。

2 移植瘤模型

移植瘤模型是指將PC細胞株或組織植入實驗動物胰腺或皮下，建立原位移植瘤模型或異位移植瘤模型［10］。

2.1 原位移植瘤模型 研究［11］發(fā)現(xiàn)，PC原位移植小鼠模型保持了人類腫瘤的結(jié)構(gòu)及其原始的抗原表型。王兆洪等［12］將瘤塊植入BALB/c小鼠胰體尾部，4周后成瘤率100%，腫瘤與周圍組織輕度黏連，未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。隨后張賀等［13］通過原位植入瘤塊于裸鼠胰腺，發(fā)現(xiàn)該方法所造模型臨床同質(zhì)性高，與人類PC的特征接近，有利于對PC療效進行全面、長期評估，更深入地研究PC發(fā)病機制。

由于新鮮臨床PC標本較難獲取，目前多選用PC細胞系復(fù)制原位移植瘤模型。而小鼠胰腺原位注射是該模型制作中的難點，其原因在于小鼠胰腺結(jié)構(gòu)較薄，局部注射容易造成癌細胞泄漏，形成腹內(nèi)傳播［14］。因此，提高胰腺原位注射效率具有重要的意義。有研究采用Matrigel基質(zhì)膠重懸癌細胞解決這一難題，Matrigel被注射入活體組織后，可隨著局部組織溫度的升高轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，從而有效防止注射點滲漏，降低了PC腹腔種植的風(fēng)險［15］，且實驗對比發(fā)現(xiàn)Matrigel組小鼠成瘤率遠高于原發(fā)性膽汁性膽管炎組［16］。因此低溫Matrigel重懸癌細胞注射法是目前建立小鼠原位PC模型的有效方法。

2.2 異位移植瘤模型 與腫瘤細胞的原位移植相比，皮下移植模型較為容易觀察腫瘤的生長情況。Guo等［17］將人源胰腺腫瘤組織碎片植入NSG裸鼠兩側(cè)腋下，6個月后約71%的小鼠成功產(chǎn)生移植瘤。除此之外，大量研究［18－19］也采用了皮下接種不同的腫瘤細胞系至BALB/c小鼠復(fù)制PC模型。

近年來研究者采用多種免疫缺陷型小鼠（腫瘤細胞移植時免疫排斥反應(yīng)較弱，有利于形成腫瘤）構(gòu)建移植瘤模型，但免疫缺陷小鼠體內(nèi)存在多種免疫細胞功能障礙，而大量研究表明，腫瘤微環(huán)境與腫瘤的生長具有密切關(guān)系［20］，所以此類模型可能無法模擬腫瘤細胞生長的微環(huán)境，在PC相關(guān)研究中存在一定的局限性。

2.3 人源異種移植（patient－derived xenografts，PDX）模型 為解決上述問題，研究者建立了PDX模型［21］，該模型依賴于將手術(shù)或活檢獲得的人源腫瘤標本直接移植到免疫低下的小鼠體內(nèi)，當瘤塊長至2 cm時，取瘤塊移植于另一免疫缺陷小鼠，45 d左右即可成功構(gòu)建PDX模型。此模型保留了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和復(fù)雜的微環(huán)境，良好保存了患者腫瘤標本的形態(tài)特征，具有更可靠的臨床預(yù)測價值［22］。

3 基因工程模型

基因工程小鼠模型是利用基因敲入、替換或敲除技術(shù)，替換、敲入或敲除某些特定基因從而誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生相應(yīng)的表型變化。

RAS基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因，RAS基因突變后可使RAS蛋白持續(xù)處于活化狀態(tài)，導(dǎo)致細胞持續(xù)增生而發(fā)生腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)95%的胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者存在RAS家族成員KRAS基因突變［23］，KRAS基因突變已經(jīng)被認為是PC中突變最早、概率最大的原癌基因。PC典型的突變是KRAS基因第12位點密碼子的突變激活，即K－RasG12D［24］。

P53是人類最常見的抑癌基因，突變的p53可促進WNT/βcatenin信號傳導(dǎo)，驅(qū)動PDAC轉(zhuǎn)移。Kim團隊［25］采用P53基因的突變體Trp53R172H與KRAS基因的突變體K－RasG12D組合構(gòu)建了LSL－KrasG12D；p53wmR172H/＋小鼠，發(fā)現(xiàn)與體細胞p53缺失相比，突變體p53R172H顯著增加了PDAC在小鼠體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移。近來研究［26］發(fā)現(xiàn)，造血信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Vav1在PDAC中表達較高，Salaymeh等［27］研究發(fā)現(xiàn)與K－RasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠相比，Vav1/K－RasG12D共表達轉(zhuǎn)基因小鼠可觀察到腺泡－導(dǎo)管化生（ADM）啟動的顯著增加，胰腺惡性腫瘤發(fā)病率更高，惡性病變出現(xiàn)的時間更短，停止Vav1的表達后胰腺腫瘤惡性病變顯著消退，表明Vav1是產(chǎn)生和維持ADM所必需的，Vav1與KRasG12D共表達可促進模型向PC發(fā)生發(fā)展。

轉(zhuǎn)基因小鼠模型給癌癥研究帶來了革命性的變化，但由于小鼠胰腺體積與人的胰腺存在巨大差異，限制了PC小鼠模型在外科或放射治療研究中的應(yīng)用［28］。相比于嚙齒動物，Principe等［29］認為豬在解剖學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)方面與人類的親緣關(guān)系更近，并有可能更準確地模擬人類的各種疾病，該課題組所誘導(dǎo)的豬胰腺腫瘤具有與人類PDAC一致的形態(tài)特征，同樣伴有致密的促結(jié)締組織增生性腫瘤間質(zhì)病變，加之人和豬免疫系統(tǒng)之間具有相似性，因此轉(zhuǎn)基因豬有可能為臨床前免疫治療提供一個更好的平臺。

基因工程PC模型的轉(zhuǎn)移模式與人類PC相似，可用于研究早期PC的發(fā)生發(fā)展，該模型極大地擴展了臨床對PC的認識，且基因工程模型可根據(jù)研究需要特定敲除或敲入某一特定基因［30］，有望成為識別和評估新的基因靶向治療策略的重要工具，但由于基因工程模型設(shè)計難度較大，操作復(fù)雜，難以大量造模，且成本較高。以上局限性限制了此種模型在PC發(fā)生機制和治療策略研究中的應(yīng)用。

4 類器官培養(yǎng)模型

目前，對PC發(fā)病機制的認識還不夠深入，迫切需要一種合適的模式來探討PC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。長期以來腫瘤機制探討中使用的細胞學(xué)研究多為傳統(tǒng)的2D（二維）細胞培養(yǎng)方式［31］，這種單一細胞培養(yǎng)模式無法模擬腫瘤組織的關(guān)鍵特征，且物種間的差異可能導(dǎo)致許多在動物宿主中成功的治療方法對人類無效［32］。近年來，類器官培養(yǎng)實現(xiàn)了患者腫瘤細胞體外培養(yǎng)的重大突破。類器官模型通過3D（三維）細胞培養(yǎng)系統(tǒng)進行培養(yǎng)［44］，形成與體內(nèi)來源的組織或器官高度相似的細胞球體，包含多種細胞，更適宜模擬腫瘤組織微環(huán)境［33－34］。

Boj等［35］將腫瘤組織剪碎，在含Wnt3a、RSPO1、50 ng/mL的表皮生長因子等的完全培養(yǎng)液中消化為單細胞后，將細胞包埋于GFR Matrigel中，用添加1μmol/L的前列腺表E2培養(yǎng)液進行培養(yǎng)形成類器官，將其原位移植于免疫缺陷小鼠后，觀察到腫瘤類器官從癌前病變逐步發(fā)展為浸潤性和轉(zhuǎn)移性癌，重現(xiàn)了腫瘤發(fā)展的全過程，因此可通過類器官建立不同階段PC模型，為PC不同發(fā)展階段機制的研究提供新的平臺。Huang等［36］使用外科手術(shù)切除的20個原發(fā)腫瘤標本建立類器官培養(yǎng)，在Matrigel中誘導(dǎo)細胞分化，使用含1%B27，50μg/mL抗壞血酸，100 ng/mL FGF2等的DMEM進行培養(yǎng)后，腫瘤類器官模型的成功率可以達到80%以上，該研究還發(fā)現(xiàn)類器官不僅與原發(fā)腫瘤表現(xiàn)出相似的形態(tài)和細胞結(jié)構(gòu)，還表達其來源的原發(fā)腫瘤的分化標志物，如KRT19、GATA6和SOX9，因此認為胰腺腫瘤類器官可被用來監(jiān)測PC的臨床治療反應(yīng)，為PC的個性化治療提供支撐。

類器官模型與體內(nèi)來源組織或器官高度相似，可以保留來源組織或器官的基因組特征和部分生理功能［37］，但截至目前該模型造模技術(shù)尚未成熟，造模所需的基質(zhì)膠、生長因子及具體操作步驟還未實現(xiàn)標準化，PC類器官模型所構(gòu)建的腫瘤微環(huán)境仍缺乏血管及免疫細胞不足，這與PC患者的腫瘤微環(huán)境還存在一定的差距，需要進一步深入探索［38］。

以上所述相關(guān)的PC造模方法各有優(yōu)缺點，現(xiàn)將其整理為表1。

表1 幾種PC造模方式優(yōu)缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of several PC modeling methods

5 問題與展望

理想的動物模型對闡明PC的發(fā)病機制、優(yōu)化PC的診斷和治療方案具有重要的意義。目前已有的動物模型可以模擬多數(shù)人類PC的特征，在此基礎(chǔ)上所開展的大量研究推動了PC的研究進展，但上述相關(guān)動物模型各有優(yōu)缺點，目前常用的造模方法為裸鼠皮下移植，異位移植模型操作簡單，便于檢測腫瘤情況，但無法模擬胰腺腫瘤微環(huán)境，而PDX模型的發(fā)展解決了這一問題，且沈曄華等［39］通過建立PC PDX模型發(fā)現(xiàn)，清胰化積方可誘導(dǎo)癌細胞凋亡，從而增強吉西他濱的療效，并在此前期研究的基礎(chǔ)上，將清胰化積方用于臨床治療［40］，發(fā)現(xiàn)清胰化積方確實可有效增強患者的帶瘤生存時間。為了更靶向地研究PC相關(guān)基因，基因工程小鼠模型應(yīng)運而生，但其造價昂貴，無法進行大規(guī)模實驗。類器官技術(shù)的發(fā)展為PC研究提供了新思路，有望創(chuàng)造出更加接近于人類PC病理結(jié)構(gòu)和微環(huán)境改變的動物模型，為PC的研究和臨床診療提供更加有力的支撐。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：延張勵負責(zé)搜集數(shù)據(jù)，撰寫論文；辛嘉萁參與修改論文；張紅、許小凡負責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。