化瘀散結(jié)灌腸液對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥盆腔痛大鼠的影響實(shí)驗(yàn)研究

宗春曉 徐 信 劉小麗 謝 偉 薛曉鷗 朱玉瑩 徐 立

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100010)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMT)是婦科常見病，臨床癥狀以痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)失調(diào)、不孕等為主，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量，但目前EMT發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。近年來研究表明，EMT與盆腔局部的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激密切相關(guān)[2-3]，核因子κB信號(hào)通路在EMT疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4-5]。

中醫(yī)認(rèn)為EMT的基本病機(jī)為瘀血阻滯沖任、胞宮，血瘀是其最基本的病理基礎(chǔ)，治療以活血化瘀為常法[6]。化瘀散結(jié)灌腸液由當(dāng)歸、川芎、赤芍、地黃、桃仁、紅花、川牛膝、三棱、莪術(shù)、丹參、鱉甲、龜甲、木通、連翹、金銀花等組成，具有活血化瘀止痛的功效。既往臨床研究表明，化瘀散結(jié)灌腸液對(duì)緩解EMT患者的痛經(jīng)、慢性盆腔痛癥狀療效確切[7]。本研究旨在觀察化瘀散結(jié)灌腸液對(duì)EMT盆腔痛模型大鼠氧化應(yīng)激因子、核因子κB通路及炎癥介質(zhì)的影響，探討化瘀散結(jié)灌腸液治療EMT盆腔痛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取40只無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)雌性SD大鼠，鼠8～10周，體質(zhì)量180～230 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物室。溫度24 ℃，濕度60%～70%，12 h明暗交替循環(huán)，自由飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)的要求，倫理審批號(hào)：20-16。

1.1.2 藥物 化瘀散結(jié)灌腸液(青海瑞成藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20025840，藥物組成：當(dāng)歸、川芎、赤芍、地黃、桃仁、紅花、川牛膝、三棱、莪術(shù)、丹參、鱉甲、龜甲、木通、連翹、金銀花)，吲哚美辛膠囊(河北永豐藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H13020834)。苯甲酸雌二醇注射液(上海全宇生物科技動(dòng)物藥業(yè)有限公司，獸藥字163232511)，縮宮素注射液(上海全宇生物科技動(dòng)物藥業(yè)有限,獸藥字163231571)。SD大鼠給藥量按照等效劑量系數(shù)折算法換算。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：大鼠白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：H002),腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：H052)，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A001-1-2)，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A003-1-2)，兔抗核因子κB p65抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0982R)，蛋白提取液(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，貨號(hào)：MDL91201)，蛋白酶抑制劑(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，貨號(hào)：MD912893)。

儀器：低溫離心機(jī)(Sigma，德國，型號(hào)：3-30K)，脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，型號(hào)：TS-100)，電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BG-subMIDI)，電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設(shè)備廠，型號(hào)：HWS-24)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF),膜(Millipore，美國，型號(hào)：ISEQ00010)，ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國，型號(hào)：170-8280)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法選取6只為假手術(shù)組，剩余大鼠采用自體子宮內(nèi)膜移植法加雌激素聯(lián)合縮宮素注射建立EMT盆腔痛大鼠模型[8-10]。造模過程具體如下：將大鼠稱重后以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，固定于手術(shù)板，腹部備皮，常規(guī)消毒。選取尿道口上1 cm處為切入點(diǎn)，向上沿前正中線縱切開1.5～2.0 cm切口，逐層打開腹壁，進(jìn)腹后找到大鼠“Y”形子宮，分離右側(cè)子宮，結(jié)扎兩端，剪下中間段約1 cm子宮組織，迅速放入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中沖洗。用眼科剪縱行剖開管狀子宮，切割成約5 mm×5 mm大小的碎片，將子宮組織內(nèi)膜面朝向腹膜縫合于左側(cè)腹膜血管豐富處，使其完全貼附于腹壁。檢查無活動(dòng)性出血后，腹腔內(nèi)注射青霉素(0.1 mL/只)以抗感染，逐層關(guān)腹，消毒切口。術(shù)后前3 d連續(xù)腹腔注射青霉素(0.1 mL/只)以抗感染。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉同造模組，只需要找到右側(cè)子宮，緊貼左側(cè)腹膜縫2針5-0尼龍線，縫合腹部傷口即可。造模4周后開腹查看造模情況，如肉眼看到移植物體積增大，移植物表面有血管形成，移植物呈小囊狀、內(nèi)含清亮液體，即判斷EMT大鼠模型造模成功。術(shù)后第2天開始肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg，2次/周，假手術(shù)組雌性SD大鼠肌內(nèi)注射等量生理鹽水。造模4周后，腹腔注射縮宮素4 U/只，出現(xiàn)扭體反應(yīng)即判斷EMT盆腔痛大鼠模型造模成功。

選取30只造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、陽性對(duì)照組、化瘀散結(jié)灌腸液低劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液高劑量灌腸組，每組6只。

1.2.2 給藥方法 造模4周后，化瘀散結(jié)灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液高劑量灌腸組分別給予每只大鼠相當(dāng)于成藥2.5 mL/kg、5 mL/kg和10 mL/kg的化瘀散結(jié)灌腸液配成的2.5 mL藥液灌腸；陽性對(duì)照組大鼠給予2.5 mg/kg吲哚美辛配成的混懸液2.5 mL灌腸；假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水灌腸。每日1次，連續(xù)灌腸4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 扭體反應(yīng)觀察 除假手術(shù)組外，其他組大鼠術(shù)后第2天開始肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg，2次/周，連續(xù)8周，假手術(shù)組大鼠肌內(nèi)注射等量生理鹽水。末次給藥后，除假手術(shù)組外，其他各組大鼠均腹腔注射縮宮素4 U/只，假手術(shù)組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，記錄大鼠30 min內(nèi)扭體次數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算扭體次數(shù)抑制率，抑制率(%)=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%。扭體反應(yīng)表現(xiàn)為大鼠腹部內(nèi)凹，身體扭曲，后肢伸張，臀部高起。

研究人員稱，父母對(duì)于子女日后的語言表達(dá)能力也起著十分重要的作用。所以嬰兒期堅(jiān)持給寶寶“磨耳朵”，日后會(huì)有意想不到的收獲哦！

1.2.3.2 取材及組織形態(tài)學(xué)觀察 造模后8周即最后1次灌腸結(jié)束后次日，麻醉大鼠進(jìn)行剖腹以獲取大鼠血清、正常子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織。腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫靜置20 min，置于離心機(jī)2 500 r/min,離心半徑7 cm，離心15 min，收集血清。取異位內(nèi)膜組織及假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行5 μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)。

1.2.3.3 血清IL-1β、TNF-α、SOD、MDA水平測(cè)定 取大鼠血清，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書檢測(cè)血清IL-1β、TNF-α表達(dá)水平。按照試劑盒說明書操作要求，用羥胺法檢測(cè)血清SOD水平，通過硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid，TBA)法檢測(cè)血清MDA水平。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)核因子κB p65蛋白表達(dá) 將異位內(nèi)膜組織或假手術(shù)組在位內(nèi)膜組織在冰上剪碎，加入細(xì)胞裂解液，冰浴上勻漿。在4 ℃條件下，12 000 r/min，離心半徑7 cm,離心15 min后取上清，加入緩沖液，經(jīng)二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量，將蛋白定量為5 mg/mL，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至PVDF膜。將PVDF膜浸入封閉液輕搖1 h封閉后，加入核因子κB p65和β-機(jī)動(dòng)蛋白一抗(稀釋比例為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后，將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用4 min。抖掉膜上液體，將其放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，分析條帶光密度(Optical Density，OD)值，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參β-機(jī)動(dòng)蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠扭體反應(yīng)比較 與模型組比較，陽性對(duì)照組大鼠扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)，其抑制率為81.63%，化瘀散結(jié)灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液高劑量灌腸組均能顯著減少大鼠扭體次數(shù)(P<0.05)，其抑制率分別為26.52%、47.95%、53.58%。見表1。

表1 各組大鼠扭體反應(yīng)比較

2.2 各組大鼠內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)比較 假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜上皮完整，柱狀上皮細(xì)胞連續(xù)整齊排列，間質(zhì)細(xì)胞排列致密整齊，微絨毛密集；模型組異位子宮內(nèi)膜可見柱狀、扁平狀、立方體狀上皮細(xì)胞增殖，間質(zhì)細(xì)胞增殖密集，可見腺體；陽性對(duì)照組及化瘀散結(jié)灌腸液灌腸組異位子宮內(nèi)膜可見柱狀上皮細(xì)胞排列致密不規(guī)則，間質(zhì)細(xì)胞疏密不等，腺體較少。見圖1。

圖1 各組大鼠內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β及TNF-α水平均升高(P<0.01)，與模型組比較，陽性對(duì)照組及化瘀散結(jié)灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液高劑量灌腸組IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

2.4 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清SOD活力降低、MDA水平升高(P<0.01)，與模型組比較，陽性對(duì)照組及化瘀散結(jié)灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液高劑量灌腸組SOD活力升高、MDA水平降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較

2.5 各組大鼠內(nèi)膜核因子κB p65蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組大鼠在位內(nèi)膜表達(dá)比較，模型組大鼠異位內(nèi)膜核因子κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，與模型組比較，陽性對(duì)照組及化瘀散結(jié)灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結(jié)灌腸液高劑量灌腸組核因子κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中核因子κB p65蛋白含量表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠核因子κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)古文獻(xiàn)中無確切EMT的病名記載，但根據(jù)EMT的主要臨床癥狀與體征，可歸屬于“痛經(jīng)”“月經(jīng)不調(diào)”“癥瘕積聚”“不孕”的范疇。本病的基本病機(jī)為“瘀血阻滯胞宮、沖任”，治法以活血化瘀為主。化瘀散結(jié)灌腸液以養(yǎng)血活血之桃紅四物湯為基礎(chǔ)方，配伍三棱、莪術(shù)以破血消癥，鱉甲、龜甲軟堅(jiān)散結(jié)，丹參化瘀涼血，連翹、金銀花清熱散結(jié)，川牛膝、木通通利血脈、引血下行。諸藥合用，共奏活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，清熱解毒之效。且灌腸液對(duì)于盆腔痛的治療具有直達(dá)病所，易于吸收，避免肝臟首過效應(yīng)，減輕胃腸刺激的優(yōu)勢(shì)。既往臨床研究表明，化瘀散結(jié)灌腸液臨床治療EMT取得良好療效，能明顯改善EMT患者疼痛癥狀，提高患者生命質(zhì)量。現(xiàn)代藥理研究表明，桃紅四物湯、丹參、三棱、莪術(shù)等具有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善血流動(dòng)力學(xué)及提高免疫力等功效。

目前關(guān)于EMT疼痛發(fā)生的機(jī)制尚未完全清楚，近期研究發(fā)現(xiàn),參與EMT盆腔痛發(fā)生的可能因素有炎癥反應(yīng)、雌激素異常、神經(jīng)纖維異常、盆腔粘連、神經(jīng)的中樞敏感化及神經(jīng)外周敏感化等[11]。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過多，氧化程度超過氧化物的清除，抗氧化劑減少，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去平衡，從而引起細(xì)胞氧化損傷。SOD是一種重要的抗氧化物酶,它可以將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,過氧化氫進(jìn)一步在過氧化氫酶和過氧化物酶催化下分解為水。氧化活性物質(zhì)增加可對(duì)不飽和脂肪酸等脂質(zhì)造成損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,可作為氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物。研究表明，氧化應(yīng)激與EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。EMT異位病灶在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)清除異物的過程中會(huì)釋放活性氧產(chǎn)物致使病變部位及其周圍組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激又能反過來誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)EMT的發(fā)展。抗氧化劑可以減弱炎癥反應(yīng)、緩解慢性盆腔痛[12-15]。

核因子κB是介導(dǎo)免疫與炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與多種復(fù)雜的細(xì)胞反應(yīng)。研究表明，核因子κB能夠通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)血管生成等機(jī)制影響外周敏化進(jìn)而建立中樞敏化，抑制核因子κB可明顯抑制EMT的發(fā)生和發(fā)展，并且減少EMT的相關(guān)疼痛癥狀[16-17]。氧化應(yīng)激是核因子κB及其下游基因的強(qiáng)誘導(dǎo)因子，活性氧類可激活子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的核因子κB通路，從而刺激IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，這些介質(zhì)一方面可以刺激前列腺素分泌，引起子宮平滑肌收縮從而導(dǎo)致疼痛，另一方面又可以正反饋核因子κB激活通路，維持病灶中核因子κB的活性、巨噬細(xì)胞募集和腹腔內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而活化周圍神經(jīng)纖維，刺激周圍神經(jīng)敏感化，改變神經(jīng)組織的電信號(hào)，引發(fā)疼痛感覺[18-20]。此外，Khan等[21]提出氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)可以相互促進(jìn)，通過相加作用進(jìn)一步促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果表明模型組血清MDA、IL-1β、TNF-α處于高水平，SOD表達(dá)降低，異位內(nèi)膜組織核因子κB表達(dá)增加，提示EMT盆腔痛模型大鼠存在氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，核因子κB參與了EMT盆腔痛的發(fā)生發(fā)展。通過化瘀散結(jié)灌腸液灌腸干預(yù)后，化瘀散結(jié)灌腸液干預(yù)組及西藥干預(yù)組可降低血清MDA、IL-1β、TNF-α水平，升高SOD水平，抑制異位內(nèi)膜組織核因子κB表達(dá)。

綜上所述，化瘀散結(jié)灌腸液能有效緩解大鼠EMT盆腔痛，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控核因子κB通路，減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生有關(guān)。但本研究僅涉及化瘀散結(jié)灌腸液對(duì)氧化應(yīng)激因子、核因子κB通路及相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響，仍有待對(duì)該通路機(jī)制進(jìn)一步研究。