魔芋葡甘露聚糖通過腸道菌群-膽汁酸途徑發(fā)揮降脂作用

鄒曉瑩，鄧 婕，鐘 靜，王 倩，何方晴，孫遠明，李美英

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

長期高脂飲食會導致血液和肝臟中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量上升，這些物質與載體蛋白結合后被輸送至其他組織，從而誘導高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病發(fā)生，同時伴隨腸道菌群失調和代謝紊亂[1-4]。近年來，多糖因其突出的降脂作用及天然安全的特性而成為最具研究價值的天然降脂食品之一，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在多糖調節(jié)血脂和代謝紊亂中發(fā)揮關鍵作用[5-7]，其中膽汁酸作為腸道微生物源性代謝物之一，與腸道菌群共同參與腸肝循環(huán)，是腸道菌群調節(jié)血脂代謝中的重要橋梁[8-9]。因此，調節(jié)腸道微生物組成及膽汁酸代謝可能是多糖改善血脂紊亂的新機制。

魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）是一種水溶性多糖，其主鏈由D-葡萄糖和D-甘露糖組成，并通過β-1,4糖苷鍵連接，平均每19個單元存在1個以酯鍵結合的乙?；鵞10]。研究表明，KGM具有良好的減肥降脂作用[11-12]，可通過減少游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺和氧化三酰甘油的生物合成以改善脂質代謝紊亂[13]。KGM難以被人體消化酶催化水解，但可被腸道菌群發(fā)酵利用，引起腸道微生物結構及腸道微生物源性代謝物發(fā)生變化[14-15]。Kang Yongbo等[16]發(fā)現(xiàn)KGM可促進埃氏巨球型菌（Megasphaera elsdenii）等有益菌的增殖，降低與肥胖相關的有害菌澤瀉菌屬（Alistipes）和金氏副桿菌菌屬（Parabacteroides goldsteinii）等相對豐度，并下調脂肪合成相關基因表達來預防肥胖。因此調節(jié)腸道菌群已成為KGM功能研究的重要切入點，而KGM對腸道菌群及其代謝物（如短鏈脂肪酸）的影響、腸道膽汁酸代謝與血脂代謝的關系鮮見報道。據(jù)此，本研究擬從腸道微生物和膽汁酸代謝角度分析KGM的降脂作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

5 周齡SPF級（無特定病原體）雄性金黃地鼠，體質量（92.76±0.40）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0009；實驗方案經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心倫理委員會批準，實驗倫理審查編號：2020B052。

基礎飼料（含11%（質量分數(shù)，下同）脂肪、21%蛋白質、68%碳水化合物）、高脂飼料（含35%脂肪、21%蛋白質，44%碳水化合物）及含2%（質量分數(shù)，下同）、6%、10% KGM的高脂飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司。

KGM（純度＞90%） 湖北花仙子魔芋制品公司；無水乙醚、氯化鈉、濃硫酸（分析純） 天津百世化工有限公司；甲酸（質譜級） 美國Thermo Fisher公司；甲醇、乙腈（質譜級） 德國默克公司；TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）試劑盒、脂質校準品 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；戊酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；異丁酸（色譜純） 德國DRE公司；膽酸（cholic acid，CA）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）、甘氨熊去氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）、脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒 廣州捷倍斯生物科技有限公司；Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）、Heiff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox） 翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

BS-380全自動生化分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；7890B氣相色譜儀 美國Agilent公司；Axio Imager D2正置熒光顯微鏡 德國Zeiss公司；Illumina MiSeq PE300測序平臺、Ultimate 3000超高效液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-exactive orbitrap mass spectroscopy，UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；QuantityStudio 3實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Applied Biosystems公司、DNA Engine PCR擴增儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與干預

以基礎飼料適應性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)體質量將地鼠隨機分為Control組、高脂模型組（high fat diet，HFD）組、2% KGM（低劑量）組、6% KGM（中劑量）組和10% KGM（高劑量）組，每組6 只。Control組飼喂基礎飼料；HFD組飼喂高脂飼料；2%、6%和10% KGM組分別飼喂含20、60、100 g/kg KGM的高脂飼料。地鼠在SPF環(huán)境飼養(yǎng)干預5 周，實驗期間自由攝食、飲水，相對濕度控制在40%～60%，室溫（22±2）℃，12 h明暗交替。每周稱量體質量并計算體質量增長量（每周體質量/g-初始體質量/g）；每天定時記錄地鼠攝食量，結果取平均值，單位為g/d。

1.3.2 樣品采集

實驗結束后，地鼠禁食不禁水7 h后，用無水乙醚麻醉，眼球取血，室溫放置2 h后，以4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液保存于-80 ℃冰箱。解剖收集肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪并稱質量，計算肝臟指數(shù)（肝臟質量/體質量×100%）。取接近回腸一側的盲腸內容物用于膽汁酸含量測定，取接近結腸一側盲腸內容物用于短鏈脂肪酸濃度測定及菌群分析。取左上肝葉、左側附睪脂肪以及距離盲腸1～2 cm處結腸用4%（質量分數(shù)）多聚甲醛溶液固定，用于病理組織切片觀察。

1.3.3 血清和肝臟脂質濃度測定

取0.1 g肝臟組織加入0.9 mL預冷生理鹽水，采用冷凍研磨機制備組織勻漿。采用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度和肝臟勻漿TC、TG濃度。

1.3.4 組織切片病理學分析

將收集的左上肝葉、左側附睪脂肪以及結腸固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋制備成切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，置于顯微鏡下觀察。

1.3.5 盲腸內容物菌群分析

取盲腸內容物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提取16S DNA，按照16S DNA V3～V4區(qū)域設計引物：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）、806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），采用Illumina MiSeq PE300平臺進行測序。按照操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分進行物種豐度組成和多樣性分析，采用非參數(shù)檢驗進行顯著性分析。

1.3.6 短鏈脂肪酸濃度測定

參考文獻[17-18]的方法提取短鏈脂肪酸，測定盲腸內容物中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸6種短鏈脂肪酸濃度及其總濃度。

1.3.7 盲腸內容物代謝譜分析

參考文獻[19]的方法對樣本進行前處理，采用UPLCQ-Exactive Orbitrap-MS測定盲腸內容物中代謝物變化。色譜條件為：采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為含體積分數(shù)（下同）0.1%甲酸的乙腈溶液，流動相B為含0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液；流速0.15 mL/min；進樣量5 μL。洗脫程序：0～1.5 min，5% A；1.5～2.0 min，25% A；2.1～4.0 min，50% A；4.1～6.0 min，70% A；6.1～9.0 min，80% A；9.1～15.5 min，95% A；15.6～16.0 min，5% A；16.1～17.0 min，5% A。參考文獻[15]的方法進行質譜參數(shù)設置和分析。采用Compound Discover 4.2軟件處理盲腸內容物代謝質譜數(shù)據(jù)，參考mz Cloud數(shù)據(jù)庫（http://www.mzCloud.org）對代謝物的保留時間和一級片段m/z進行定性分析。利用SIMCA-P 14.0軟件對各組代謝物峰面積（去除空白樣峰面積）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析以及差異代謝物篩選，并在Metaboanalyst 5.0數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca/）中進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析以及類別富集分析。

1.3.8 盲腸內容物膽汁酸質量濃度測定

為進一步分析盲腸內容物代謝物中膽汁酸質量濃度變化，對上述盲腸內容物代謝譜分析方法進行優(yōu)化，高分辨質譜采用電噴霧電離離子源，采用負離子模式，參照表1優(yōu)化碰撞能，同時根據(jù)保留時間、一級片段、二級碎片離子信息進行定性，根據(jù)不同膽汁酸化合物峰面積采用外標法計算其質量濃度。

表1 膽汁酸質譜分析條件Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of bile acids

1.3.9 實時熒光定量PCR測定

參考總RNA提取試劑盒說明書提取地鼠肝臟組織RNA，反轉錄得到cDNA，-20 ℃保存。根據(jù)美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫和文獻[20]設計引物（表2）。參照Heiff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox）試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR，反應條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s；60 ℃、34 s；40個循環(huán)。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算肝臟組織中各基因表達水平。

表2 金黃地鼠肝臟膽汁酸合成相關基因PCR引物Table 2 Primer sequences used for PCR amplification of genes related to bile acid synthesis in liver tissues of golden hamsters

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設置兩次平行，結果以平均值±標準差表示。利用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistic 21軟件進行單因素方差分析，若方差齊性時采用最小顯著差異法進行顯著性分析，若不具備方差齊性，采用非參數(shù)檢驗-Tamhane檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 KGM對高脂血癥金黃地鼠體質量增長與攝食量的影響

如表3所示，6%和10% KGM干預組地鼠體質量增長量顯著低于HFD組（P＜0.05），表明6%和10% KGM可抑制高脂飲食導致的體質量增長，而2% KGM組體質量增長量在第4、5周相較HFD組無顯著差異（P＞0.0.5）。各組地鼠干預期間攝食量無明顯差異（圖1）。

表3 KGM對高脂血癥金黃地鼠體質量增長量的影響Table 3 Effect of KGM on body mass gain in hyperlipidemic hamsters g

圖1 KGM干預期間各組金黃地鼠攝食量Fig. 1 Effect of KGM on food intake in hyperlipidemic hamsters

2.2 KGM對高脂血癥金黃地鼠肝臟與組織脂肪質量的影響

如表4所示，與HFD組相比，3個KGM干預組中6%、10% KGM干預后肝臟質量分別顯著下降16.00%（P＜0.05）和14.64%（P＜0.05），附睪脂肪和腎周脂肪質量干預前后無顯著變化（P＞0.0.5）。同時，Control組肝臟指數(shù)與HFD組相比存在顯著差異（P＜0.05），但KGM干預組較HFD組無顯著差異（P＞0.0.5）。

表4 KGM對高脂血癥金黃地鼠肝臟、腎周脂肪和附睪脂肪質量的影響Table 4 Effect of KGM on liver, perirenal fat and epididymal fat mass in hyperlipidemic hamsters

如圖2所示，肝臟及附睪脂肪組織切片顯示，相較HFD組，6%和10% KGM組肝細胞排列趨于整齊，脂質空泡數(shù)量減少（黑色箭頭）且附睪細胞脂肪細胞體積較小。

圖2 KGM對高脂血癥金黃地鼠肝臟和附睪脂肪組織形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of KGM on histomorphology of liver and epididymal fat in hyperlipidemic hamsters

2.3 KGM對高脂血癥金黃地鼠血清與肝臟脂質水平的影響

如表5所示，與HFD組相比，6%和10% KGM干預后血清中TC濃度分別顯著下降33.85%和28.17%（P＜0.05），TG濃度分別顯著下降32.04%和32.21%（P＜0.05），LDL-C濃度分別顯著下降46.57%和39.26%（P＜0.05），HDL-C濃度分別顯著下降19.78%和15.40%（P＜0.05），表明6%和10% KGM可顯著抑制高脂飲食導致的血清脂質濃度升高。此外，6% KGM組肝臟TC、TG濃度顯著低于HFD組，2% KGM組TC濃度和10%KGM組TG濃度相較HFD組顯著降低（P＜0.05）。

表5 KGM對高脂血癥金黃地鼠血清和肝臟脂質濃度的影響Table 5 Effect of KGM on serum and hepatic lipid levels in hyperlipidemic hamsters mmol/L

2.4 KGM對高脂血癥金黃地鼠短鏈脂肪酸和結腸組織結構的影響

與HFD組相比，2%和10% KGM組乙酸濃度顯著上升（P＜0.05），6% KGM組有上升趨勢（P＞0.05）。2%、6%和10% KGM組丁酸濃度分別較HFD組顯著上升22.09%、31.40%和23.26%（P＜0.05），丙酸和戊酸濃度同樣存在上升趨勢，但均差異不顯著（表6）。各KGM干預組總短鏈脂肪酸濃度均顯著上升（P＜0.05），表明KGM在一定程度具有調節(jié)短鏈脂肪酸的能力。病理切片（圖3）顯示HFD組結腸組織杯狀細胞（黑色圓圈）生長異常，固有層受損，絨毛萎縮，黏膜下層結構（黑色箭頭）受損，2%、6%和10% KGM均具有緩解杯狀細胞生長異常的作用。

表6 KGM對高脂血癥金黃地鼠短鏈脂肪酸濃度的影響Table 6 Effect of KGM on short fatty acid levels in hyperlipidemic hamsters mmol/L

圖3 KGM對高脂血癥金黃地鼠結腸組織結構的影響（200×）Fig. 3 Effect of KGM on the structure of colon tissues in hyperlipidemic hamsters (200 ×)

2.5 KGM對高脂血癥金黃地鼠腸道菌群多樣性的影響

圖4A顯示，HFD組、2%、6%和10% KGM組Shannon指數(shù)均顯著高于Control組（P＜0.05），表明HFD組、2%、6%和10% KGM組腸道菌群alpha多樣性相較Control組顯著升高。主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）結果如圖4B所示，PC1、PC2貢獻率分別為34.35%和17.19%，Control組與HFD組區(qū)別明顯，隨著KGM干預劑量的增加，KGM干預組樣本點逐漸遠離HFD組，說明隨著KGM干預劑量的增加，金黃地鼠腸道菌群組成與HFD組區(qū)別逐漸明顯。

圖4 KGM對高脂血癥金黃地鼠腸道菌群多樣性的影響Fig. 4 Effect of KGM on the diversity of gut microbiota in hyperlipidemic hamsters

2.6 KGM對金黃地鼠腸道菌群物種組成和差異物種的影響

基于門水平分類，各組腸道菌群組成如圖5所示。高脂飲食可導致厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bateroidota）相對豐度比值（F/B）發(fā)生顯著變化（P＜0.05），10% KGM干預后F/B較HFD組顯著降低。同時，HFD組厚壁菌門、擬桿菌門、脫硫菌門（Desulfobacterota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和放線菌門（Actinobacteriota）在腸道菌群中相對豐度分別為86.16%、1.16%、8.77%、1.33%和2.28%。與HFD組相比，2% KGM組脫硫菌門相對豐度（2.58%）明顯減少，6% KGM組放線菌門相對豐度（0.43%）明顯減少，10% KGM組擬桿菌門相對豐度（18.49%）明顯上升，脫硫菌門相對豐度（1.77%）和放線菌門相對豐度（0.42%）明顯下降。

圖5 KGM對高脂血癥金黃地鼠腸道菌群門分類水平物種組成的影響Fig. 5 Effect of KGM on the composition of gut microbiota at the phylum level in hyperlipidemic hamsters

圖6 KGM對高脂血癥金黃地鼠腸道菌群屬分類水平物種組成的影響Fig. 6 Effect of KGM on the composition of gut microbiota at the genus level in hyperlipidemic hamsters

基于屬水平分類，各組腸道微生物物種構成和優(yōu)勢菌屬分布情況如圖6A所示。進一步分析各組間的差異菌屬，5 組共有39個差異菌屬，其中6%和10% KGM干預后棒狀桿菌（Corynebacterium）、嗜膽菌屬（Bilophila）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、安德克氏菌屬（Adlercreutzia）和戈登氏桿菌屬（Gordonibacter）等相對豐度顯著下降（圖6B、C）。

2.7 KGM對高脂血癥金黃地鼠盲腸內容物代謝物的影響

如圖7A所示，對各樣本中的代謝物峰面積進行PCA，結果顯示HFD組樣本點與Control組明顯分離，6%和10% KGM組與HFD組代謝輪廓存在顯著差異，2% KGM組樣本點與HFD組距離更近。將HFD組分別與Control組、不同劑量KGM組比較，以變量投影重要性（variable important in projection，VIP）值＞1且P＜0.05為條件篩選出51種差異代謝物（圖7B），經(jīng)代謝物類別富集分析后，將代謝物歸類為膽汁酸和脂肪酸等12個類別，其中膽汁酸類化合物數(shù)量占比（24%）最高（圖7C）。進一步對代謝物進行KEGG通路富集分析，與KGM影響高脂血癥金黃地鼠盲腸內容物代謝物相關的通路主要涉及嘌呤代謝、初級膽汁酸生物合成和脂肪酸生物合成等8 條通路（圖7D）。

圖7 KGM對高脂血癥金黃地鼠盲腸內容物代謝物的影響Fig. 7 Effect of KGM on metabolites in cecal contents from hyperlipidemic hamsters

2.8 KGM對高脂血癥金黃地鼠盲腸內容物膽汁酸的影響

如圖8所示，與HFD組相比，6%、10% KGM干預后DCA和LCA質量濃度顯著降低（P＜0.05），并使GCA質量濃度顯著升高（P＜0.05）。同時，與HFD組相比，6% KGM組UDCA顯著升高，6%和10% KGM組CA質量濃度與HFD組相比分別升高4.65 倍和8.35 倍，但無顯著差異。

圖8 KGM對高脂血癥金黃地鼠盲腸內容物膽汁酸質量濃度的影響Fig. 8 Effect of KGM on bile acid levels of cecal contents from hyperlipidemic hamsters

2.9 顯著變化菌屬相對豐度與膽汁酸、血脂水平Spearman相關性分析結果

對差異菌屬的相對豐度和膽汁酸、血脂水平進行Spearman相關性分析（圖9），結果表明，UDCA質量濃度與Lachnoclostridium、Acetatifactor和鏈球菌屬（Streptococcus）等9個菌屬相對豐度呈顯著正相關；CA質量濃度與Parasutterella等3個菌屬相對豐度呈顯著正相關，與乳桿菌屬、嗜膽菌屬相對豐度呈顯著負相關；DCA質量濃度與雙歧桿菌屬、棒狀桿菌屬、Parvibacter、Lachnospiraceae_UCG-010等7個菌屬相對豐度呈正相關，與Lachnospiraceae_NK4A136_group和副桿菌屬等5個菌屬相對豐度呈現(xiàn)負相關；LCA質量濃度與脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、Lachnoclostridium、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、棒狀桿菌屬、戈登氏桿菌屬和嗜膽菌屬等22個菌屬相對豐度呈顯著正相關，與Lachnospiraceae_NK4A136_group等6個菌屬相對豐度呈負相關；GCA質量濃度與Acetatifactor、Eisenbergiella和Parasutterella等9個菌屬相對豐度呈顯著正相關，與norank_f__Lachnospiraceae和乳桿菌屬相對豐度呈現(xiàn)負相關。TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度主要與雙歧桿菌屬、戈登氏桿菌屬、糞桿菌（Faecalibacterium）和Enbacterium_brachy_group等12個菌屬菌呈現(xiàn)顯著相關。此外，TC濃度與脫硫弧菌屬、Lachnoclostridium等8個菌屬相對豐度呈現(xiàn)顯著正相關；TG濃度與脫硫弧菌屬、棒狀桿菌屬和嗜膽菌屬等6個菌屬相對豐度呈顯著正相關；HDL-C濃度與嗜膽菌屬、脫硫弧菌屬及Lachnoclostridium等8個菌屬相對豐度呈顯著正相關；LDL-C濃度與鏈球菌屬及Lachnospiraceae_UCG-006等7個菌屬相對豐度呈顯著正相關。

圖9 金黃地鼠腸道菌群顯著變化菌屬與膽汁酸、血脂水平Spearman相關性分析結果Fig. 9 Spearman’s correlation analysis of significantly changing gut bacterial genera and bile acids from hyperlipidemic hamsters

2.10 KGM對高脂血癥金黃地鼠膽汁酸代謝基因調控的影響

KGM對高脂血癥金黃地鼠肝臟為法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、小異二聚體伴侶受體（small heterodimer partner，SHP）和膽汁酸合成關鍵酶膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）基因表達的影響如圖10所示。與HFD相比，2%、6%和10% KGM干預后肝臟FXRmRNA相對表達水平顯著下降。6% KGM組肝臟CYP7A1mRNA相對表達水平與其他組相比顯著上升，10% KGM組肝臟CYP7A1基因表達較HFD組顯著上調43.27%（P＜0.05）。同時6%、10% KGM組金黃地鼠的SHPmRNA表達水平高于Control、HFD以及2% KGM組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖10 KGM對高脂血癥金黃地鼠肝臟FXR（A）、SHP（B）和CYP7A1（C）mRNA表達的影響Fig. 10 Effect of KGM on relative mRNA expression of FXR (A),SHP (B) and CYP7A1 (C) in liver from hyperlipidemic hamsters

3 討 論

高脂飲食導致機體血液中TG和TC含量升高，二者與載體蛋白結合后被輸送到組織中，從而誘導糖尿病、動脈粥樣硬化等相關代謝疾病的發(fā)生[1,21]。本研究中HFD組可顯著提高血清TC、TG和LDL-C以及肝臟TC、TG濃度，說明高脂動物模型構建成功。補充5 周6%、10% KGM后，地鼠血清和肝臟脂質水平顯著下降，與HFD組相比，脂肪細胞體積變小,肝臟脂質空泡數(shù)量減少，這與以往研究結果[13,16]一致。

具有膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活力的腸道菌群是調節(jié)機體膽汁酸代謝的重要菌群，主要包括雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬（Bacteroides）和李斯特菌屬（Listeria）等[9,22]。它們在回腸中發(fā)揮去結合作用將結合膽汁酸轉化為非結合膽汁酸，隨后非結合膽汁酸在羥基化和差向異構化作用下轉化為DCA、LCA和UDCA等次級膽汁酸[22-24]。Wan Yi等[25]對307 名健康人群開展為期6個月不同脂肪含量的膳食干預研究，發(fā)現(xiàn)高脂飲食會促進具有BSH活力的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等菌群增殖，同時顯著增加DCA含量。本研究中，具有BSH活力的菌群在各干預組呈現(xiàn)了不同的變化趨勢，HFD組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等菌群相對豐度顯著增加，與Wan Yi等[25]研究結果一致[25]。與HFD組相比，6%、10% KGM干預組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬相對豐度顯著下降，DCA、LCA質量濃度顯著降低。同時相關性分析結果顯示DCA、LCA及血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均與雙歧桿菌屬相對豐度呈顯著正相關。以上結果表明KGM可能通過降低具有BSH活力菌屬相對豐度來減少次級膽汁酸DCA和LCA質量濃度，調節(jié)脂質紊亂和改善腸道健康。嗜膽菌屬作為一種膽汁酸耐受菌屬，可將?；悄懰徂D化為DCA，因此嗜膽菌屬數(shù)量增多同樣會導致DCA含量顯著升高[26]，本研究中6%和10% KGM干預后，與TG、HDL-C濃度顯著正相關的嗜膽菌屬相對豐度顯著下降，表明KGM可抑制嗜膽菌屬增殖從而降低DCA質量濃度，并與血脂水平存在顯著相關性。此外，本研究以VIP值＞1、P＜0.05為條件篩選出51種盲腸內容物差異代謝物，主要參與初級膽汁酸合成和脂肪酸生物合成等8 條代謝通路，其類別富集分析結果顯示膽汁酸類代謝物數(shù)量占比24%，在所有代謝物類別中最高，進一步表明膽汁酸在KGM調節(jié)血脂紊亂中發(fā)揮重要作用。

膽汁酸是膽固醇從體內排出的主要途徑，膽固醇通過CYP7A1和CYP8B1等膽汁酸合成關鍵酶生成CA和CDCA，并與肝細胞中甘氨酸和?；撬峤Y合，以結合膽汁酸的形式被釋放到膽囊和小腸中[27-28]。經(jīng)過回腸中腸道菌群的修飾作用轉化的膽汁酸，對肝臟FXR有調節(jié)作用[29-30]。在肥胖小鼠中，F(xiàn)XR可誘導肝臟中FXR和成纖維細胞生長因子15（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF15）信號通過門靜脈與肝細胞表面受體結合，抑制CYP7A1表達，從而抑制膽汁酸合成[31-32]。本研究結果顯示6% KGM可抑制肝臟中FXR基因表達，從而上調CYP7A1基因表達，促進肝臟中膽固醇合成膽汁酸以減少肝臟中TC濃度，在Shi Linlin等[33]的麥冬多糖對高脂血癥小鼠膽汁酸影響的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的調控途徑。

綜上，KGM或通過降低具有BSH活力的腸道菌群雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和嗜膽菌屬相對豐度，抑制結合型初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸DCA和LCA，同時上調CYP7A1的mRNA表達促進CA生成，從而發(fā)揮調節(jié)脂質紊亂及改善腸道黏膜損傷的作用。