單核細胞增生李斯特菌生物被膜交叉污染評估進展

王 真，方太松，王 園,2，趙婕秀，李卓思，秦曉杰，王 翔，董慶利,*

（1.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；2.上海中僑職業(yè)技術大學食品藥品學院，上海 201514）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種兼性厭氧型、無芽孢的革蘭氏陽性短桿菌，是“四大食源性致病菌”中致死率最高的一類[1]。2020年美國疾病預防控制中心的流行病學研究顯示，美國李斯特菌病患者的死亡率為21%[2]。2018年歐洲食品安全局和歐洲疾病預防控制中心報告顯示歐洲各國李斯特菌病患者死亡率為15.6%[3]。中國大陸2011—2017年間報告的562 例散發(fā)型李斯特菌病患者中非圍產(chǎn)期患者死亡率為23.78%，圍產(chǎn)期患者流產(chǎn)或新生兒死亡率為32.68%[4]。

單增李斯特菌在食品接觸表面大多以生物被膜模式，而不是以浮游模式存在。生物被膜是微生物對生存空間和營養(yǎng)物質(zhì)進行有效競爭以及抵御不良環(huán)境的一種生存策略。生物被膜態(tài)和浮游菌態(tài)相比表型不同，一旦形成生物被膜，胞外聚合物質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）可充當物理和化學屏障保護內(nèi)部細菌，增強致病菌暴露于脅迫環(huán)境時的抵抗能力[5]。并且單增李斯特菌進入食品加工鏈后，在生物被膜形成階段后期會有浮游菌體從生物被膜中脫落分散到周圍環(huán)境中，進而開始新一輪生物被膜的形成，導致交叉污染持續(xù)發(fā)生，加劇單增李斯特菌在整個食品鏈的傳播，從而威脅食品安全并引起相對嚴重的疾病負擔和經(jīng)濟損失。

單增李斯特菌通過特定宿主傳播導致食源性疾病發(fā)生不是其傳播的唯一途徑，交叉污染即通過直接或間接接觸轉(zhuǎn)移到未污染食品上，消費者食用被單增李斯特菌污染的食品是其傳播到人體的主要途徑[6]。據(jù)報道，全球每年約有20億致病菌通過食物傳播導致的病例，其中100多萬病例死亡[7]，食品污染80%的來源是食品接觸表面和非接觸面所形成的生物被膜[8]。當食品接觸面不再是單層附著的浮游態(tài)菌體，而是含有EPS的多層生物被膜時，EPS組分可能會影響單增李斯特菌在食品接觸表面上的黏附特性和數(shù)量，因此菌體的交叉污染轉(zhuǎn)移情況就變得更復雜，目前也無專門針對單增李斯特菌生物被膜交叉污染相關的系統(tǒng)總結(jié)。

基于此，本文首先介紹了單增李斯特菌生物被膜的EPS，并深入探討了形成單增李斯特菌生物被膜時影響其交叉污染轉(zhuǎn)移的內(nèi)外部因素和相關研究內(nèi)容；其次，對單增李斯特菌生物被膜的早期防控進行了較為全面的概述；最后，對未來研究前景提出展望，以期降低單增李斯特菌生物被膜交叉污染引發(fā)的食源性疾病風險從而保障食品安全。

1 單增李斯特菌生物被膜

生物被膜也稱生物膜或菌膜，指微生物附著于食品接觸面或非食品接觸表面，由細菌及其自身分泌的黏性EPS組成，經(jīng)生長增殖形成具有一定空間結(jié)構和復雜代謝系統(tǒng)的高度組織化細菌群體[9]。生物被膜的形成有助于微生物在不利環(huán)境中生存，其能夠提供以下表型多樣性和生態(tài)優(yōu)勢：1）產(chǎn)生EPS保護內(nèi)部菌體免受周圍環(huán)境影響；2）通過營養(yǎng)交換和去除潛在有毒代謝物來增強營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性和代謝協(xié)作；3）通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得新的遺傳特征（例如抗生素抗性基因）[10]。

生物被膜形成的動態(tài)演變過程主要分為5個階段：菌體黏附于接觸表面→產(chǎn)生EPS→形成微菌落→微菌落轉(zhuǎn)化為成熟生物被膜→生物被膜中活細胞向周圍環(huán)境分散。根據(jù)EPS產(chǎn)生與否進一步被劃分為可逆黏附和不可逆黏附2個階段[9]。

如表1所示，蛋白質(zhì)、多糖和胞外脫氧核糖核酸（extracellular deoxyribonucleic acid，eDNA）作為單增李斯特菌EPS的主要組分，與生物被膜形成密切相關，其構成了生物被膜3D結(jié)構的基本骨架。各組分在生物被膜形成的不同方面如初始黏附、內(nèi)聚、群體感應（quorum sensing，QS）、細胞膜結(jié)構和營養(yǎng)代謝等都發(fā)揮著重要作用，影響著單增李斯特菌生物被膜結(jié)構和功能的完整性。生物被膜的形成賦予單增李斯特菌高耐受性和持久性，造成交叉污染，威脅食品安全。

表1 EPS的主要組分及作用Table 1 Major components and functions of EPS

2 單增李斯特菌生物被膜交叉污染與食品安全

單增李斯特菌在食品加工設備和環(huán)境中持續(xù)存在，特別是在低溫等不利條件下的獨特持久性是引起人類李斯特菌病持續(xù)性暴發(fā)的重要原因[23]。并且持久性菌株比散發(fā)性菌株形成的生物被膜更厚，且瞬時接觸時持久性菌株表現(xiàn)出更強的黏附性，促使其在食品加工設備中存活并成為交叉污染的傳播中心[24]。基于Gusnaniar等[25]的研究，圖1重繪并演示了生物被膜菌體既可以通過破壞生物被膜-供體的界面張力發(fā)生轉(zhuǎn)移，也可以通過破壞生物被膜的內(nèi)聚力發(fā)生轉(zhuǎn)移。但在自然形成的生物被膜中，菌體之間的距離遠超出理化作用范圍，故破壞生物被膜內(nèi)聚力發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況更普遍。

圖1 生物被膜菌體的轉(zhuǎn)移場景Fig. 1 Transfer scenes of biofilm-forming bacteria

交叉污染指菌體從已被污染的物體表面經(jīng)過直接或間接的方式轉(zhuǎn)移至未受污染的物體表面（食品或其他接觸面）的過程。交叉污染發(fā)生在全食品鏈中的任一階段，導致其發(fā)生的常見因素有：1）不恰當?shù)氖称诽幚砹晳T；2）已被污染的待加工食品；3）受致病菌感染的食品處理人員[26-27]。交叉污染對于低劑量感染的致病菌尤為重要[28]，GB 29921—2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》[29]規(guī)定單增李斯特菌的限量標準為“25 g樣品中不得檢出”，德國、法國等歐盟國家即食食品中單增李斯特菌限量標準為不高于100 CFU/g[30]，單增李斯特菌在即食食品中的檢出很少超過限量標準，但是李斯特菌病例確診人數(shù)卻在逐年增加[3]。Willis等[31]在水果、蔬菜以及果蔬混合物中均檢出單增李斯特菌，其污染水平全部不高于100 CFU/g，但是分離菌株卻與李斯特菌病暴發(fā)菌株相關。生物被膜的形成提高了單增李斯特菌的污染概率，交叉污染擴大了單增李斯特菌在全食品鏈中的傳播范圍，經(jīng)交叉污染途徑轉(zhuǎn)移的微量單增李斯特菌在適宜生存環(huán)境且存在易感人群條件下引起潛在的食源性疾病暴發(fā)風險需更加重視。近年來國內(nèi)外交叉污染導致的李斯特菌病暴發(fā)事件如表2所示。

表2 交叉污染導致李斯特菌病暴發(fā)事件Table 2 Listeriosis outbreak caused by cross-contamination

由表2可知，被污染的肉制品特別是食用前不經(jīng)加熱處理的即食熟肉及其肉制品是食源性李斯特菌病的主要誘因，同時，與新鮮農(nóng)產(chǎn)品相關的李斯特菌病例暴發(fā)也受到了更廣泛的關注。如冰淇淋相關的李斯特菌病暴發(fā)事件表明單增李斯特菌獨特的持久性與其在低溫環(huán)境下的存活能力有關[38]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)肉汁會影響生物被膜的形成，并加劇其在食品鏈中的傳播[44]，此外，曾經(jīng)被認為是去污的采后洗滌過程因為水、水中的顆粒物質(zhì)以及果蔬之間的接觸會導致交叉污染的發(fā)生，現(xiàn)在也被視為發(fā)生交叉污染的高風險點[41,45]。對于李斯特菌病暴發(fā)是否源于持續(xù)存在的單增李斯特菌交叉污染，可采用WGS、MLST、wg-MLST和PFGE等方法溯源分析來自于食品及其所涉及工廠、分銷商的食品加工設備和環(huán)境中的分離株與病例來源菌株的同源性來揭示。

3 單增李斯特菌生物被膜交叉污染影響因素

生物被膜形成過程中會影響其結(jié)構功能、組成成分、細胞和細胞以及細胞和接觸表面的相互作用，會對菌體后續(xù)的潛在轉(zhuǎn)移過程產(chǎn)生影響。單增李斯特菌生物被膜的存在與否取決于形成過程中的影響因素，同時這些因素也會影響單增李斯特菌總數(shù)量與黏附特性，進而導致轉(zhuǎn)移量差異。以下結(jié)合單增李斯特菌生物被膜形成過程中的影響因素以進一步闡明影響單增李斯特菌生物被膜交叉污染的因素。

3.1 外部環(huán)境條件因素

接觸表面的粗糙度會影響單增李斯特菌在接觸表面的黏附，粗糙表面提供了更大的表面積供單增李斯特菌定植。粗糙表面比光滑表面上可能會發(fā)生更多的單增李斯特菌轉(zhuǎn)移，Gkana等[26]定量研究了影響單增李斯特菌從接觸表面轉(zhuǎn)移到牛肉的因素，結(jié)果表明木質(zhì)表面（2.77（lg（CFU/g）））單增李斯特菌的轉(zhuǎn)移量高于不銹鋼和塑料表面（2.66（lg（CFU/g）））。宋筱瑜[46]、董慶利[47]等的相關研究中也得到了在同一轉(zhuǎn)移場景下木質(zhì)表面單增李斯特菌的轉(zhuǎn)移率顯著高于其他材料表面。

生物被膜的轉(zhuǎn)移量與其在接觸面上的生成量相關。接觸面的疏水性會影響接觸表面單增李斯特菌的黏附性和可以轉(zhuǎn)移的數(shù)量。Choi等[48]研究發(fā)現(xiàn)生物被膜形成能力與疏水性呈正相關。Yi等[49]研究了生菜葉和食品接觸表面（玻璃、聚乙烯）間的交叉污染，結(jié)果表明菌體的轉(zhuǎn)移率隨食品表面疏水性的增加而增加。

初始接種量是影響生物被膜細胞轉(zhuǎn)移的另一重要因素。初始接種量會影響生物被膜的形成過程，處于可逆黏附或不可逆黏附階段的生物被膜根據(jù)EPS的存在與否從接觸表面脫落所需的作用力不同。研究表明107CFU/mL和105CFU/mL初始接種量的單增李斯特菌EDGe在25 ℃孵育14 d期間，分別在第3天和第5天觀察到生物被膜形成量達到最大[50]。因此，為獲得準確的細菌轉(zhuǎn)移率定量數(shù)據(jù)必須考慮初始接種量的影響。

同時，環(huán)境中營養(yǎng)成分的可利用性也與單增李斯特菌生物被膜的形成量有重要的聯(lián)系。營養(yǎng)成分會影響EPS的分泌，從而導致單增李斯特菌的黏附性差異，進而影響轉(zhuǎn)移情況。Lakicevic等[51]比較了20 株單增李斯特菌在胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）和營養(yǎng)肉湯2種培養(yǎng)基中生物被膜的形成能力，結(jié)果表明所有的單增李斯特菌菌株均可在聚苯乙烯上形成生物被膜，且在營養(yǎng)豐富的TSB培養(yǎng)基中生物被膜形成量更多。生物被膜的轉(zhuǎn)移量取決于接觸面上生物被膜的形成量，因此，環(huán)境中營養(yǎng)的可利用性也會間接影響生物被膜的轉(zhuǎn)移。

3.2 內(nèi)部微生物自身因素

菌株的血清型是影響生物被膜形成的因素之一，Wang Wenkai等[52]的研究表明，單增李斯特菌血清型1/2b比1/2a的生物被膜形成能力強；Harvey等[53]研究發(fā)現(xiàn)譜系II中的1/2a和1/2c比譜系I中4b和1/2b生物被膜形成能力強。然而Dhowlaghar等[54]研究發(fā)現(xiàn)，血清型1/2b、3b、4b和4c的生物被膜形成能力沒有顯著性差異。生物被膜形成能力的強弱會對轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，Keskinen等[55]研究了生物被膜形成能力不同的單增李斯特菌轉(zhuǎn)移差異，結(jié)果表明生物被膜形成能力強的菌株表現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)移能力，且生物被膜形成6 h比24 h的轉(zhuǎn)移菌量多。

生物被膜會因EPS的組分和含量不同形成不同空間結(jié)構，可能會導致活菌的數(shù)量和分布不同，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移差異。單增李斯特菌中的eDNA對生物被膜的形成具有顯著影響，Zetzman等[56]的研究結(jié)果證實了eDNA在低滲透活性物質(zhì)濃度的介質(zhì)中對單增李斯特菌生物被膜形成具有重要作用。同時，eDNA可通過調(diào)節(jié)酸堿作用增強單增李斯特菌在不同接觸表面的黏附[19]，故eDNA的存在可能會導致轉(zhuǎn)移差異。

QS系統(tǒng)會影響單增李斯特菌在接觸表面的初始黏附和生物被膜形成能力。Gandra等[57]的研究確定了agrBCD基因?qū)τ趩卧隼钏固鼐じ胶蜕锉荒ば纬傻闹匾裕貏e是在培育12 h和24 h時。另外，呋喃糖基硼酸二酯作為自誘導因子2（auto inducer-2，AI-2），是生物被膜形成時QS的通用信號分子，能夠調(diào)控細菌的聚集、鞭毛合成以及運動基因，已有研究證實合成AI-2分子會影響菌體在玻璃和不銹鋼表面的黏附以及后續(xù)到牛肉、豬肉、薩拉米香腸、哈密瓜、生菜等不同類型食品的轉(zhuǎn)移[58]。由此可見，QS能通過控制下游基因的表達來調(diào)控生物被膜形成以及細菌運動能力，故可通過干擾QS抑制生物被膜的形成和轉(zhuǎn)移。

代謝系統(tǒng)和QS系統(tǒng)之間存在關聯(lián)，會影響單增李斯特菌對營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性、EPS的產(chǎn)生和生物被膜的形成。營養(yǎng)缺乏時補充前體代謝物信號分子S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）能夠誘導生物被膜形成，編碼EPS合成機制的基因表達受SAM和/或Agr QS系統(tǒng)調(diào)控，并且這種調(diào)控依賴于細菌從浮游態(tài)到固著態(tài)的轉(zhuǎn)變[59]。接觸表面上生物被膜的轉(zhuǎn)移會受接觸表面生物被膜形成量的影響，然而生物被膜形成及抗性背后復雜的調(diào)控機制尚未得到足夠的研究，揭示合作性共存的潛在機理有利于更好地評估生物被膜交叉污染風險。

4 單增李斯特菌生物被膜交叉污染研究

4.1 交叉污染的研究類型

實驗室模擬研究通過控制特定實驗條件和因素進行研究，其無法解釋真實復雜情況中的全部影響因素，但可確定某些特定影響因素，從而更好地理解交叉污染的復雜本質(zhì)?，F(xiàn)場研究各因素雖不可控，但能識別真實環(huán)境中的交叉污染途徑且接近真實情況。

在實驗室模擬生物被膜轉(zhuǎn)移場景時，應盡可能地考慮交叉污染過程的復雜性以更加接近真實環(huán)境。除去常規(guī)影響因素，如接觸面材質(zhì)、溫度、接觸時間以外，目標菌株的采樣地點也應納入考慮，說明菌株采樣地點如經(jīng)過清洗消毒的接觸表面或生產(chǎn)過程中的設備表面或廚房接觸面，有利于區(qū)分菌株的持久性和散發(fā)性[24]。目前對單增李斯特菌生物被膜形成能力的研究通?；谟欣诩毦L的實驗室培養(yǎng)基，由于營養(yǎng)的可利用性、離子強度和pH值等因素，真實食品加工環(huán)境中的生物被膜的生長、存活情況可能會與實驗室環(huán)境中的評估結(jié)果存在差異。研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌能夠在豬肉汁、雞肉汁、牛肉汁和三文魚肉汁中存活并形成生物被膜，且生物被膜培養(yǎng)基是影響單增李斯特菌存活和產(chǎn)生抗性的主導因素，因為肉汁有利于單增李斯特菌存活，其存活情況在人工培養(yǎng)基中會被低估。同時，在肉汁中形成的生物被膜更厚、細胞密度更大，對化學消毒劑的抗性更強[24,44]。此外，進行單增李斯特菌生物被膜菌體轉(zhuǎn)移模擬實驗時，為了使接觸表面兩面的菌體都能夠轉(zhuǎn)移，通常使用夾心法進行接觸轉(zhuǎn)移研究[60]。

現(xiàn)場研究是在各種影響因素不受控制的條件下，不考慮影響轉(zhuǎn)移的因素和過程，側(cè)重于量化細菌轉(zhuǎn)移時發(fā)生的頻率以及識別工廠、零售店和廚房等真實環(huán)境中的污染路徑[61]。已有研究通過直接采訪食品處理人員并利用接觸性瓊脂獲取其手上微生物污染樣本，確定了食品處理人員的手是菌體轉(zhuǎn)移的重要媒介[62]。Evans等[63]針對60 歲以上的老年人，使用模擬廚房直接觀察其食品操作習慣，并結(jié)合微生物學分析，明確了冰箱把手、砧板、水池、毛巾、水龍頭和抹布等是交叉污染中微生物來源的潛在途徑。另外，Barril等[64]對肉店中的生碎牛肉和肉類接觸面進行采樣，結(jié)果證實大多數(shù)肉店存在單增李斯特菌污染的風險，且不同肉店菌株的核糖體分型存在相關性，揭示了交叉污染潛在風險。

綜上，這兩種類型的研究數(shù)據(jù)都可以為暴露評估（交叉污染模型）、風險管理和風險交流提供定性或定量信息。因此，將實驗室仿真模擬研究結(jié)果和現(xiàn)場研究信息相結(jié)合有助于識別交叉污染潛在路徑，更加準確評估單增李斯特菌生物被膜交叉污染對公眾健康的危害。

4.2 交叉污染的細菌收集

對食品接觸表面和周圍區(qū)域進行常規(guī)表面取樣能夠監(jiān)測食品加工環(huán)境中單增李斯特菌生物被膜污染情況和檢驗清潔消毒措施的有效性。然而，無效的取樣技術或工具可能導致單增李斯特菌存在但無法檢出，阻礙及時實施防控措施，導致安全假象產(chǎn)生[65]。此外，不同研究者的操作慣性差異也可能導致菌體的低回收率和低重現(xiàn)性，使得不同研究結(jié)果難以比較[66]。深入了解影響菌株收集的因素能夠標準化菌體收集方法，有助于科學準確評估單增李斯特菌生物被膜轉(zhuǎn)移的潛在風險。

拭子法操作簡單，長期以來是進行實驗室研究和環(huán)境監(jiān)測的常用表面取樣方法[67]。不同的材料類型的拭子工具如棉簽拭子、海綿拭子、植絨拭子和刮刀拭子等能夠較好地收集不銹鋼、塑料和橡膠等不同材料食品接觸表面的單增李斯特菌，并且不同取樣工具所得檢測結(jié)果沒有顯著性差異[68]；另外，采用棉簽拭子或海綿拭子取樣時，可以預先使用滅菌緩沖蛋白胨水等潤濕以提高取樣效率。棉簽拭子是小面積取樣時的理想選擇，但大面積（＞100 cm2）取樣時更適合采用海綿拭子[69]。對食品接觸表面的生物被膜采用拭子法取樣時，可將棉簽拭子法和刮刀拭子法結(jié)合使用，刮刀拭子法適用于對生物被膜的EPS進行分析，其結(jié)果略低于真實水平但不會干擾蛋白質(zhì)、多糖等成分測定。而對于微生物計數(shù)，棉簽拭子法比刮刀拭子法略微有效，但差異不顯著[70]。

采用拭子法從接觸表面收集細菌時，還應考慮接觸表面類型導致的結(jié)果差異，如孔隙率、粗糙度、疏水性和材料成分。Jones等[67]研究發(fā)現(xiàn)，無論是高（106～107CFU/cm2）和低（0.01～1 CFU/cm2）接種量情況下，相比于不銹鋼和塑料接觸面，多孔、粗糙的木質(zhì)接觸面上單增李斯特菌回收率均最低，且在低接種量下差異顯著。不銹鋼是常見的食品加工設備材料，研究發(fā)現(xiàn)其表面結(jié)構不影響單增李斯特菌的回收率，但會影響單增李斯特菌的細胞活力，并且與聚丙烯和高密度聚乙烯相比，不銹鋼表面的細胞活動均下降，表明細菌的回收率也受接觸表面材料成分的影響。

除表面特性外，微生物在接觸表面的種類和細胞密度也會影響回收率。革蘭氏陽性或陰性菌特征會影響干燥表面細菌的收集[69]。革蘭氏陽性菌（如單增李斯特菌）在細胞外層含有蛋白質(zhì)組成的多層肽聚糖層，而革蘭氏陰性菌（如沙門氏菌）的肽聚糖層膜要薄得多，這種形態(tài)會影響細菌在表面上的黏附方式。細菌初始接種水平也是影響評估表面微生物回收率的重要因素。實驗室研究中往往在高濃度（單位面積菌量大于104CFU）時能獲得期望的研究結(jié)果，但在較低接種水平時菌體收集幾乎沒有。需要進一步在高接種水平下，通過逐步降低接種水平來評估取樣方法的檢測限[67]。另外，接種后接觸表面的干燥時間會影響菌體的收集，如低接種量（100 CFU/250 cm2）條件下，在不銹鋼、高密度聚乙烯和橡膠表面接種后立即取樣和風干1 h后取樣，不同取樣時間檢測結(jié)果之間存在顯著差異[68]。

采樣后需謹慎選用收集細菌所用的介質(zhì)溶液，介質(zhì)溶液的成分應可恢復亞致死細胞的生長而不是致其死亡，同時應避免促進或抑制正常細胞的生長，以防高估或低估微生物的污染水平。如果收集的介質(zhì)溶液中不含中和消毒劑殘留物的成分，可能會低估細菌污染水平并且有利于具有高抗性的細菌存活。單增李斯特菌和接表面消毒劑殘留物的成分被同時取樣并放置在同一介質(zhì)溶液中時，出現(xiàn)單增李斯特菌假陰性結(jié)果的可能性會增加[28,71]。傳統(tǒng)的檢測方法沒有考慮到不可培養(yǎng)細胞的存活情況，會導致活的不可培養(yǎng)細胞未被檢測收集，從而誤判食品加工接觸表面的衛(wèi)生狀況，造成潛在的交叉污染發(fā)生[72]。

5 單增李斯特菌生物被膜交叉污染的預防與控制

成熟生物被膜黏附牢固、結(jié)構致密。早期生物被膜三維結(jié)構尚未形成，黏附松散、結(jié)構脆弱，附著的細菌對抗菌化合物敏感性更高，此時去除生物被膜具有明顯的優(yōu)勢。故抑制早期生物被膜的形成可阻礙其發(fā)展為成熟生物被膜，減少生物被膜的相關危害。

5.1 降低可逆黏附

在接觸表面增加親水涂層是減少細菌初始黏附的常用方法?；诓煌姾芍g的相互作用以及菌體表面的疏水特性，在接觸表面涂覆親水涂層可減少細菌黏附，防止早期生物被膜形成。有研究表明，經(jīng)聚二乙醇改性的不銹鋼接觸表面粗糙度降低，親水性提升，單增李斯特菌在改性后的接觸表面上初始附著和生物被膜形成量降低90%以上[73]。納米粒子有機硅烷能通過固液相互作用改變接觸面的親/疏水性，能與玻璃、不銹鋼接觸面上的無機底物反應形成穩(wěn)定的共價鍵和有機取代，影響生物被膜的初始黏附和形成，但是以上反應高度依賴菌種和接觸表面性質(zhì)[74]。

除親水涂層外，在接觸表面涂抗菌劑直接殺滅附著的細菌是抑制細菌可逆黏附的有效方法。銀離子具有廣譜殺菌活性，銀涂層表面對生物被膜的形成具有顯著抑制作用[75]。銀納米粒子因其具有納米材料性質(zhì)和銀的抗菌性能也是一種理想抗菌物質(zhì)[76]?？咕淖鳛橐环N堿性多肽，不易受細菌耐藥性影響，Oger等[77]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽作用于接觸表面時細菌的初始黏附性降低了50%，說明抗菌肽是具有前景的抗生物被膜涂層。

單增李斯特菌每個細菌細胞約有4～6 條鞭毛，鞭毛可介導細胞運動，并可作為表面黏附素，對在非生物接觸表面形成生物被膜至關重要[78]。以鞭毛為靶點防止細菌運動和黏附也能有效控制早期生物被膜形成。相關研究表明抗生物被膜活性和抗細菌運動性明顯相關，植物分子番茄堿、氯化鋅、乙二胺四乙酸以及凝固酶陰性葡萄球菌中較復雜的細菌化合物混合物能夠顯著抑制細菌的游動能力，使細菌停留在浮游階段，阻止其初始附著，減少生物被膜的形成[79-80]。

5.2 抑制EPS的產(chǎn)生

EPS的產(chǎn)生表明細胞從可逆黏附轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡骛じ?。抑制EPS產(chǎn)生、降低可逆黏附是控制早期生物被膜形成的重要目標。表3總結(jié)了針對蛋白質(zhì)、多糖和eDNA這3種EPS主要組分開展的部分研究，以了解針對EPS開展防控措施能否有效去除單增李斯特菌生物被膜。

由表3可知，減少胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)和eDNA是去除早期生物被膜的重要策略。但是，抑菌物質(zhì)的作用機理還有待繼續(xù)深入挖掘，如丁香精油作用于生物被膜后eDNA含量變化不明顯的原因，推測可能一方面丁香酚與DNA嵌合導致eDNA含量下降；另一方面丁香精油處理破壞了生物被膜結(jié)構后直接作用于細菌，細菌裂解并釋放DNA，導致eDNA含量增加，綜合兩方面原因?qū)е耬DNA含量變化不明顯[82]，但具體原因仍需進一步研究。近年來，由于對化學消毒劑等具有抗性的單增李斯特菌的出現(xiàn)，天然植物提取物如精油（芳香植物中產(chǎn)生的天然揮發(fā)性酚類化合物）、細菌素（革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌包括乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽）以及具有抗菌活性的益生菌及其上清液作為安全且被證實對單增李斯特菌生物被膜具有抑制作用的物質(zhì)[87]，理應引起更多關注和研究。

5.3 抑制群體感應

QS是生物被膜細胞間通訊和檢測細胞密度的過程，主要發(fā)生在生物被膜形成的初始聚集階段，細菌處于不利脅迫條件時，會通過QS系統(tǒng)發(fā)出信號，使細菌聚集并形成生物被膜[88]。針對QS通路的抑制可通過3種方式：阻斷信號分子合成、防止信號分子與受體結(jié)合以及降解生成的信號分子。

5.3.1 阻斷信號分子合成

信號分子合成使細胞能夠監(jiān)測環(huán)境和調(diào)控基因表達[89]，阻斷信號分子合成阻礙了細胞間和種間的交流。革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)由酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactone，AHL）信號分子介導[90]。香豆素作用后導致編碼信號分子的基因lasI、rhlI和pqsBCH下調(diào)，阻礙AHL分子合成和假單胞菌喹諾酮信號（Pseudomonasquinolone signal，PQS）系統(tǒng)反應，從而減少生物被膜形成。丁香酚與香豆素作用機理相似，通過下調(diào)las、rhl以及PQS的幾個關鍵基因，影響銅綠假單胞菌的泳動能力和生物被膜形成[91]。另外，水楊酸也能通過與AHL生成所需的底物結(jié)合而干擾其形成AHL信號分子[92]。

5.3.2 防止信號分子與受體結(jié)合

信號分子轉(zhuǎn)導亦會干擾QS系統(tǒng)影響生物被膜形成。在單增李斯特菌等革蘭氏陽性菌中，QS信號分子分為寡肽自誘導因子和AI-2分子，其中AI-2分子是目前所知唯一能進行種內(nèi)和種間交流的通用信號分子，單增李斯特菌生物被膜形成時的細胞通訊主要是通過響應功能性AI-2分子[93]。呋喃酮作為天然抗菌劑，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的QS系統(tǒng)均具有破壞性。合成呋喃酮化合物能夠干擾AI-2分子影響QS系統(tǒng)，抑制來源于食品、環(huán)境的單增李斯特菌早期生物被膜形成[94]。呋喃酮結(jié)構上與AHL相似，能夠取代AHL與相應的LasR受體結(jié)合抑制QS系統(tǒng)[95]。

5.3.3 降解生成的信號分子

降解生成的QS信號分子使其不能達到參與生物被膜調(diào)節(jié)的閾值水平，能夠削弱生物被膜的形成能力。研究表明，最低亞抑菌濃度的AL705細菌素能夠使QS系統(tǒng)的信號分子失活，干擾QS，抑制生物被膜；另外，在生物被膜形成過程中所涉及的不同于AI-2的其他分子可能是細菌素的作用靶點[96]。

6 結(jié) 語

目前針對單增李斯特菌的研究關注點更多是聚焦在能否在接觸表面上附著形成微菌落（也稱生物被膜形成能力）以及在各種逆性環(huán)境下的存活能力和耐受性。但是，單增李斯特菌對人造成的潛在健康風險和經(jīng)濟損失，不僅取決于其在接觸表面的生物被膜形成能力和對逆性環(huán)境的耐受性，還取決于單增李斯特菌生物被膜交叉污染轉(zhuǎn)移到其他接觸表面的可能性。在“農(nóng)場到餐桌”的全食品鏈中，單增李斯特菌生物被膜交叉污染對食品安全造成的威脅是無法回避的問題，因此未來此領域的深入研究可從以下幾方面展開：1）應深入研究即食食品經(jīng)交叉污染途徑被單增李斯特菌生物被膜污染后，生物被膜在即食食品上的生長、存活或轉(zhuǎn)移情況。目前更多的研究是關注致病菌生物被膜從不同材質(zhì)食品接觸表面到無污染即食食品的轉(zhuǎn)移。如將相關研究結(jié)果納入定量風險評估中，能科學準確評估單增李斯特菌生物被膜危害，降低食源性疾病暴發(fā)風險；2）采用更恰當標準的取樣和檢測方法，將研究變量和取樣方法標準化。未來研究單增李斯特菌生物被膜的危害時，在選取高風險食品基礎上應結(jié)合食品的內(nèi)在特征（pH值、水分活度、防腐劑、背景微生物群落）和貯藏方式（溫度和貨架期長短）等設計交叉污染場景研究轉(zhuǎn)移過程，以獲取更可靠的真實場景下定量轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)，闡明單增李斯特菌生物被膜持久性污染原因；3）將毒力、代謝等多種信號轉(zhuǎn)導途徑和QS調(diào)控相結(jié)合探究單增李斯特菌生物被膜形成機制，對殺菌劑和消毒劑產(chǎn)生的抗性機制制定有針對性的防控生物被膜策略。生物被膜的形成過程不僅受細菌細胞所暴露的理化因素影響，還受復雜調(diào)控網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)。此外，在食品接觸表面上存在的微生物具有高度多樣性，這些其他微生物的存在可能會增強或減弱單增李斯特菌交叉污染的潛在轉(zhuǎn)移。多角度探究生物被膜形成背后的復雜調(diào)控機制，對評估真實環(huán)境中單增李斯特菌生物被膜的種群動態(tài)變化和遺傳學信息具有積極的影響。