王煒哲，翟征遠(yuǎn)，郝彥玲

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

0 引 言

抗生素使用導(dǎo)致的微生物耐藥已成為世界范圍內(nèi)醫(yī)療健康、食品安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的最大威脅之一。用于人類及畜牧行業(yè)疾病治療的抗生素主要包括大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和磺胺類等抗生素[1]?？股厥褂谜{(diào)查結(jié)果顯示，醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖等行業(yè)均存在著抗生素濫用現(xiàn)象，30%～50%的臨床病例中存在抗生素施用過(guò)量[2]；獸用抗生素僅有小部分被動(dòng)物吸收代謝，30%～90%的抗生素最終隨動(dòng)物排泄物排到環(huán)境中[3]，給臨床治療和環(huán)境中的細(xì)菌帶來(lái)選擇壓力，導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的種類和數(shù)量不斷增加。國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告規(guī)定,2020年7月起企業(yè)停止生產(chǎn)含有除中藥外的促生長(zhǎng)類藥物的商品飼料，中國(guó)飼料進(jìn)入了無(wú)抗時(shí)代[4]。

近年來(lái)，由于觀察到抗生素耐藥基因在有益細(xì)菌和致病菌之間的水平傳播，人們對(duì)食源性乳酸菌及其抗生素抗性的重視程度不斷增加[5]，耐藥性研究也從臨床相關(guān)菌株擴(kuò)展到食源性乳酸菌。國(guó)際上規(guī)定用于酸奶發(fā)酵劑等食品工業(yè)菌株需具有無(wú)致病基因、無(wú)毒性代謝物、無(wú)抗生素耐藥基因轉(zhuǎn)移潛力等生物安全特性[6]。然而，在中國(guó)、土耳其、俄羅斯多個(gè)國(guó)家市售酸奶中分離出的發(fā)酵劑乳酸菌已鑒定到多種抗生素抗性，多重耐藥率較高，同時(shí)部分菌株攜帶可轉(zhuǎn)移耐藥基因[7-9]。在乳制品生產(chǎn)加工過(guò)程中或人體腸道內(nèi)，這些耐藥基因存在著向益生菌或致病菌轉(zhuǎn)移的潛在安全問(wèn)題[10]。本文匯總了市售酸奶發(fā)酵劑乳酸菌耐藥表型、基因型及耐藥性轉(zhuǎn)移研究，明確了加強(qiáng)發(fā)酵劑乳酸菌抗藥性監(jiān)測(cè)及耐藥基因轉(zhuǎn)移研究的重要意義[7]。

1 酸奶發(fā)酵劑乳酸菌耐藥性檢測(cè)方法及分布耐藥表型

1.1 乳酸菌耐藥性檢測(cè)方法

藥物敏感性實(shí)驗(yàn)是體外檢測(cè)抗菌藥物對(duì)微生物有無(wú)抑制作用的方法，是目前實(shí)驗(yàn)室及臨床常用的細(xì)菌耐藥性測(cè)定方法[11]，包括定性測(cè)定和定量測(cè)定。定性測(cè)定是通過(guò)測(cè)量固體培養(yǎng)基上抑菌圈的大小，判斷受試菌株耐藥情況，包括K-B紙片擴(kuò)散法、打孔法、牛津杯法等[12]。定量測(cè)定包括稀釋法和E-test法，稀釋法通過(guò)測(cè)定乳酸菌在不同濃度藥物培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況判斷其最低抑菌濃度（MIC）或最低殺菌濃度（MBC），依據(jù)培養(yǎng)基不同又可分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法[12]；E-test法，通過(guò)讀取受試菌株抑菌圈與包被著指數(shù)梯度抗生素試紙條的交點(diǎn)處刻度，獲取最低抑菌濃度[11]。

針對(duì)乳酸菌耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）提供了乳桿菌及乳球菌碳青霉烯類、大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類等抗生素的耐藥評(píng)判依據(jù)[13]。歐洲食品安全局（EFSA）提供了慶大霉素、鏈霉素和萬(wàn)古霉素等8種抗生素的判定標(biāo)準(zhǔn)[14]。另外，歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）提供了腸球菌耐藥評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[15]。上述標(biāo)準(zhǔn)是目前乳酸菌耐藥性評(píng)判的重要依據(jù)[14]。

1.2 酸奶發(fā)酵劑乳酸菌耐藥表型

商業(yè)酸奶不同于自然發(fā)酵乳制品，其工業(yè)化生產(chǎn)中使用了商業(yè)發(fā)酵劑，為酸奶生產(chǎn)的品質(zhì)控制提供保證。市售酸奶中除了應(yīng)用最為廣泛的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌，嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等也常被用作益生菌添加入酸奶發(fā)酵劑。然而近年來(lái)，多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)市售發(fā)酵乳制品中分離出的乳酸菌對(duì)抗生素存在耐藥性，發(fā)酵劑菌種的耐藥檢測(cè)及安全性評(píng)價(jià)成為研究熱點(diǎn)。

1.2.1 對(duì)抑制蛋白質(zhì)合成抗生素的耐藥性分析

在抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素中，乳桿菌和嗜熱鏈球菌對(duì)氨基糖苷類抗生素具有較高的耐藥性，其中對(duì)卡那霉素和鏈霉素的耐藥最為廣泛[10,16,-17]。乳桿菌及嗜熱鏈球菌對(duì)四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出不同程度的耐受情況，于濤等[18]利用紙片擴(kuò)散法鑒定到31株乳桿菌中的四環(huán)素耐藥率為61.3%，25株嗜熱鏈球菌中四環(huán)素耐藥率為20.0%，而分離自北京市售酸奶的70株乳桿菌及30株嗜熱鏈球菌均表現(xiàn)四環(huán)素敏感[17]；Yang等[19]利用微量肉湯稀釋法鑒定到43株乳桿菌氯霉素耐藥率為58.1%，39株嗜熱鏈球菌氯霉素耐藥率為71.8%，而分離自邯鄲市售酸奶的48株乳桿菌氯霉素耐藥率僅為2.08%，43株嗜熱鏈球菌均表現(xiàn)為氯霉素敏感[19]。大部分乳桿菌和嗜熱鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類類抗生素表現(xiàn)為敏感，分離自邯鄲市售酸奶的48株乳桿菌分離株僅有2.08%對(duì)紅霉素耐藥，43株嗜熱鏈球菌均表現(xiàn)為紅霉素敏感[20]。

1.2.2 對(duì)抑制細(xì)胞壁合成的抗生素耐藥性分析

在抑制細(xì)胞壁合成的抗生素中，幾乎全部的干酪乳桿菌和植物乳桿菌表現(xiàn)為萬(wàn)古霉素耐藥[20]，但大量的嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種為萬(wàn)古霉素敏感菌株[19,22]。嗜熱鏈球菌對(duì)萬(wàn)古霉素則表現(xiàn)出不同程度的耐受，Erginkaya等[8]對(duì)土耳其發(fā)酵乳制品中分離的乳酸菌進(jìn)行耐藥分析，發(fā)現(xiàn)40%嗜熱鏈球菌為萬(wàn)古霉素耐藥，而分離自廣州市售酸奶的乳酸菌中，僅有8%嗜熱鏈球菌為萬(wàn)古霉素耐藥[10]。嗜熱鏈球菌和乳桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素，如青霉素、氨芐青霉素和頭孢呋定等敏感，例如，北京市售酸奶分離的37株乳桿菌和15株嗜熱鏈球菌對(duì)青霉素和氨芐青霉素均敏感[22-23]。

1.2.3 對(duì)抑制核酸合成的抗生素耐藥性分析

在抑制核酸合成的抗生素中，乳桿菌和嗜熱鏈球菌對(duì)喹諾酮類抗生素具有一定的耐受性，如環(huán)丙沙星、萘啶酸和達(dá)氟沙星等，其中環(huán)丙沙星耐藥比率最高。凡琴?gòu)?7個(gè)品牌酸奶中分離的14株嗜熱鏈球菌和21株乳桿菌均表現(xiàn)為萘啶酮酸、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星及多粘菌素E耐藥[7]。石磊等利用E-test法和紙片擴(kuò)散法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離自廣州市售酸奶的23株乳桿菌也表現(xiàn)為100%的環(huán)丙沙星耐藥率[10]。

1.2.4 對(duì)抑制葉酸合成的抗生素耐藥性分析

在葉酸合成抑制類藥物中，大部分乳桿菌對(duì)磺胺類抗生素表現(xiàn)為耐藥，Xu等[24]利用微量肉湯稀釋法對(duì)33株從酸奶分離的乳桿菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，54.6%的菌株表現(xiàn)為磺胺甲惡唑耐藥。嗜熱鏈球菌對(duì)磺胺類抗生素顯現(xiàn)不同程度的耐受性，25株酸奶及發(fā)酵劑分離的嗜熱鏈球菌耐藥分析發(fā)現(xiàn)22.27%的菌株表現(xiàn)為復(fù)方新諾明耐藥[25]，而分離自紹興市售酸奶的嗜熱鏈球菌對(duì)復(fù)方新諾明全部表現(xiàn)為敏感[26]。

2 酸奶發(fā)酵劑乳酸菌耐藥基因的攜帶情況

乳酸菌的耐藥表型與其攜帶的耐藥基因具有相關(guān)性，且攜帶耐藥基因本身就會(huì)給乳酸菌的安全應(yīng)用帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[12]。研究人員利用分子生物學(xué)方法，如耐藥基因PCR擴(kuò)增、DNA微陣列和全基因組測(cè)序等從市售酸奶分離乳酸菌中鑒定到多種耐藥基因[27]。

2.1 糖肽類和喹諾酮類的耐藥基因

萬(wàn)古霉素是糖肽類抗生素，能夠與敏感菌株細(xì)胞壁前體五肽D-丙氨酰-D-丙氨酸以氫鍵連接，從而阻斷肽聚糖的聚合，而在抗性菌株中D-丙氨酰-D-丙氨酸被D-丙氨酰-D-絲氨酸或D-丙氨酰-D-乳酸取代，導(dǎo)致萬(wàn)古霉素結(jié)合能力下降[28]。大多數(shù)乳桿菌具有編碼D-丙氨酰-D-絲氨酸連接酶vanE基因[21]和D-丙氨酰-D-丙氨酸水解酶的vanX基因[28]。D-丙氨酰-D-丙氨酸水解酶VanX與D-乳酸脫氫酶、羧肽酶、D-丙氨酰-D-乳酸連接酶協(xié)同將細(xì)菌細(xì)胞壁五肽末端修飾為D-丙氨酰-D-乳酸[29]。

環(huán)丙沙星是喹酮類抗生素，通過(guò)抑制DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的功能，阻斷DNA復(fù)制發(fā)揮抑菌功能[30]。Jiang等從酸奶分離的環(huán)丙沙星抗性乳桿菌中，編碼DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因gyrA和parC發(fā)生突變，導(dǎo)致抗生素與靶位點(diǎn)的結(jié)合能力下降，菌株表現(xiàn)為環(huán)丙沙星耐藥[31]。

2.2 氨基糖苷類和四環(huán)素的耐藥基因

慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素是氨基糖苷類抗生素，通過(guò)與敏感菌株核糖體30S亞基A位點(diǎn)結(jié)合，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成[32]。氨基糖苷類抗生素耐藥基因以編碼修飾酶為主，通過(guò)對(duì)抗生素的修飾，降低其與核糖體結(jié)合能力，從而產(chǎn)生耐藥性。aph（3′）IIIa編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)卡那霉素抗性[33]。aac(6′)-aph(2′′)編碼雙功能復(fù)合酶，既有6'乙酰轉(zhuǎn)移酶，又有2'磷酸轉(zhuǎn)移酶活性[34]，介導(dǎo)慶大霉素抗性[35]。ant(6)編碼核苷轉(zhuǎn)移酶在鏈霉素耐藥中占主導(dǎo)地位，此外，酸奶發(fā)酵劑菌株中還發(fā)現(xiàn)了其他鏈霉素耐藥基因，如氨基糖苷-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因strA、氨基糖苷-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因strB、氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因aadA和aadE[19,25,36]。

四環(huán)素類抗生素通過(guò)阻礙氨酰-tRNA與核糖體A位點(diǎn)的結(jié)合來(lái)抑制蛋白質(zhì)合成[37]。四環(huán)素耐藥基因種類繁多，包括編碼核糖體保護(hù)蛋白的tetM、tetO、tetS、tetW和編碼外排泵的tetK、tetL等抗性基因[17,19,22]，其中tetM、tetS、tetK和tetL是酸奶發(fā)酵劑乳酸菌中常見(jiàn)的四環(huán)素耐藥基因。

2.3 大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類抗生素的耐藥基因

紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，當(dāng)紅霉素與敏感菌株核糖體23S rRNA結(jié)合時(shí)，tRNA轉(zhuǎn)位受到干擾，新生肽鏈的延伸被阻斷[38]。市售酸奶中分離到的編碼紅霉素抗性的主要基因?yàn)閑rmB和mefA[36]。ermB編碼rRNA甲基化酶，在乳酸菌紅霉素耐藥中占主導(dǎo)地位，該酶催化23S rRNA的2058位腺嘌呤核苷酸甲基化修飾，使紅霉素與靶位點(diǎn)的結(jié)合能力下降[39]。mefA編碼紅霉素外排泵系統(tǒng)，通過(guò)將菌體內(nèi)的紅霉素排出體外，提高菌體對(duì)紅霉素的抗性。

磺胺類藥物，利用對(duì)氨基苯磺酸與氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，阻斷細(xì)菌中二氫葉酸的生物合成[40]，其增效劑甲氧嘧啶可抑制二氫葉酸還原酶活性。酸奶發(fā)酵劑乳酸菌中鑒定到，突變的二氫葉酸合成酶基因sulI和sulII使抗生素與靶位點(diǎn)的結(jié)合能力降低，菌株表現(xiàn)為磺胺類抗生素耐藥[18-19]。突變的二氫葉酸還原酶基因drfA和drfD能夠介導(dǎo)一定水平的甲氧芐啶耐藥性，在酸奶乳桿菌分離株中均有鑒定[21,41]。

此外，乳酸菌耐藥研究中發(fā)現(xiàn)耐藥表型與耐藥基因型之間存在著不一致性。部分對(duì)某種抗生素敏感的乳酸菌也可能攜帶與其相關(guān)的耐藥基因。秦宇軒等[17]用PCR特異性擴(kuò)增結(jié)合測(cè)序的方法在紅霉素和四環(huán)素敏感的乳酸菌中檢測(cè)到相應(yīng)的耐藥基因，這種潛在的耐藥基因無(wú)法與耐藥表型相關(guān)聯(lián)，更容易在安全性評(píng)價(jià)中被忽視，使食源性乳酸菌成為耐藥基因的蓄水池。與之相反的是，部分耐藥乳酸菌未鑒定到對(duì)應(yīng)的耐藥基因，研究人員對(duì)乳酸菌的耐藥研究多借鑒臨床致病菌的機(jī)制，而乳酸菌對(duì)某些抗生素的耐藥機(jī)制可能與病原菌不同，使得其耐藥基因未被探明，研究人員需進(jìn)一步針對(duì)乳酸菌研究其耐藥機(jī)制，為乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

3 乳酸菌耐藥性轉(zhuǎn)移

微生物耐藥性可以分為固有耐藥和獲得性耐藥。固有耐藥是指依靠自身基因組包含的耐藥基因而具有對(duì)某類抗生素的抗性，其耐藥性能夠穩(wěn)定遺傳[42]。獲得性耐藥分為菌體基因自發(fā)突變[9]和通過(guò)轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒等移動(dòng)元件[25]水平轉(zhuǎn)移兩種方式，其中水平轉(zhuǎn)移是耐藥基因獲得的主要途徑[43]。

氨基糖苷類抗生素是乳桿菌和嗜熱鏈球菌固有耐藥，萬(wàn)古霉素、喹諾酮類及磺胺類抗生素同樣列入乳桿菌固有耐藥，而四環(huán)素和紅霉素耐藥基因常與乳酸菌質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座元件有關(guān)。具有固有耐藥性的乳酸菌理論上是安全的，但是區(qū)分基因?qū)用娴墓逃行院瞳@得性耐藥非常困難，判斷一株菌株對(duì)某種抗生素是否為固有耐藥的最準(zhǔn)確的方式是研究其耐藥基因是否會(huì)發(fā)生傳遞，因此乳酸菌的耐藥基因是否轉(zhuǎn)移是研究者們?cè)u(píng)價(jià)乳酸菌安全性的重點(diǎn)內(nèi)容，研究已發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌的幾種抗性基因可在乳酸菌與乳酸菌、乳酸菌與病原菌之間發(fā)生傳遞，所以完善針對(duì)商業(yè)菌種的耐藥性安全評(píng)價(jià)已刻不容緩。

乳酸菌耐藥基因轉(zhuǎn)移性研究主要采用體外試驗(yàn)，濾膜結(jié)合法是常用的體外結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法。Yang等[19]利用濾膜接合法將四環(huán)素耐藥基因tetM和tetS分別從德氏乳桿菌保加利亞亞種和植物乳桿菌轉(zhuǎn)移到單增李斯特菌L82，轉(zhuǎn)移率為7.3×10-7～2.9×10-6；Nawaz等[22]通過(guò)濾膜結(jié)合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離自發(fā)酵乳制品的發(fā)酵乳桿菌MWL24的ermB基因，能夠轉(zhuǎn)移至糞腸球菌181，轉(zhuǎn)移率為2.62±0.81×10-5;植物乳桿菌MWL22的tetM基因，能夠轉(zhuǎn)移至糞腸球菌181，轉(zhuǎn)移率為1.39±0.06×10-5。乳酸菌抗性基因體內(nèi)的轉(zhuǎn)移性研究目前較少，F(xiàn)eld等[45]檢測(cè)到位于植物乳桿菌中質(zhì)粒p LFE1上的ermB可在無(wú)菌小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)向糞腸球菌的轉(zhuǎn)移，而在無(wú)特定病原體（SPF）小鼠中未發(fā)現(xiàn)水平轉(zhuǎn)移[45]。同樣從酸奶發(fā)酵劑分離的紅霉素抗性的德氏乳桿菌保加利亞亞種，攜帶有編碼外排泵蛋白的msrC基因。但在SPF級(jí)裸鼠腸道也未檢測(cè)到msrC基因轉(zhuǎn)移[46]，作者推測(cè)腸道微生物群落可能作為保護(hù)屏障，發(fā)揮抑制耐藥性轉(zhuǎn)移的作用。Toomey等[47]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵乳基質(zhì)中乳酸乳球菌477的四環(huán)素耐藥基因tetM能夠轉(zhuǎn)移至乳酸乳桿菌BU-2-60中，表明在發(fā)酵乳等食品基質(zhì)中耐藥基因也能夠在不同的細(xì)菌間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移。

4 結(jié)論

乳酸菌耐藥性像一把“雙刃劍”，一方面能夠提高菌體在含有抗生素的環(huán)境中的存活率，另一方面也存在耐藥基因向食品或腸道中其他微生物轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致耐藥基因的傳播。食品、微生態(tài)制劑生產(chǎn)菌株的安全性是食品安全的重要保障，歐洲食品安全局（EFSA）強(qiáng)調(diào)[14]野生菌株到工業(yè)菌株的審批流程中應(yīng)將抗生素敏感性測(cè)定作為必要的安全性指標(biāo)，同時(shí)應(yīng)對(duì)申報(bào)菌株的耐藥基因及其可移動(dòng)性在實(shí)驗(yàn)室水平和實(shí)際生產(chǎn)條件下進(jìn)一步探究，并以長(zhǎng)期安全性為原則，在菌株使用中及時(shí)監(jiān)測(cè)其耐藥性的變化，將風(fēng)險(xiǎn)降到最低。此外，鑒于乳酸菌在治療抗生素相關(guān)性腹瀉上已得到臨床證明，乳酸菌固有耐藥性的研究也為臨床抗生素優(yōu)化施用提供新思路[48]。固有耐藥的益生菌株和抗生素聯(lián)合施用，實(shí)現(xiàn)藥物殺菌和菌群抑制的協(xié)同作用，既減少了抗生素的用量又為抗生素使用后腸道菌群恢復(fù)提供了益生菌補(bǔ)充。