寧心暖，李 潔，房 輝，余思源，梁家禧，張 璐，靳亞平，周 棟

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 楊凌 712100)

根據(jù)奶牛分娩過程中的生理及產(chǎn)道變化、胎兒及胎衣在產(chǎn)道中的運(yùn)行特點(diǎn)等，可將奶牛的正常分娩過程分為3個(gè)階段，即子宮頸口開張期、胎兒產(chǎn)出期、胎衣排出期。在奶牛分娩時(shí)，胎兒在奶牛努責(zé)2～4 h后仍未被排出即可判定發(fā)生難產(chǎn)[1]。難產(chǎn)由多種因素引起[2]，會(huì)增加母牛淘汰率，嚴(yán)重者甚至引起母牛死亡，嚴(yán)重影響奶牛繁育工作[3-5]。在牧場產(chǎn)房接產(chǎn)數(shù)據(jù)記錄中，一般用4分制來記錄產(chǎn)犢的難易程度[6]。產(chǎn)犢評(píng)分2分及以上為輔助產(chǎn)犢，即助產(chǎn)。助產(chǎn)是當(dāng)母牛不能夠完成自然分娩時(shí)，需要進(jìn)行的人工輔助產(chǎn)犢措施，而在產(chǎn)犢過程中，助產(chǎn)的發(fā)生非常普遍。產(chǎn)后健康的子宮在以前通常被認(rèn)為是無菌的[7]，但最近的研究表明，子宮并非無菌的，并有特定的微生物群[8-9]。Moore等[10]在未受精的青年牛和懷孕母牛子宮內(nèi)均檢測到了微生物，且證實(shí)了建立和維持妊娠需要有菌壞境。Serrano等[11]發(fā)現(xiàn)綿羊生殖道的微生物組成是導(dǎo)致人工輸精成敗的主要原因。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)奶牛難產(chǎn)的研究有所增加，隨著基因序列和功能基因篩選以及高通量測序等技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)于子宮健康和疾病相關(guān)的微生物組有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)[12-13]。臨床奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病與化膿隱秘桿菌(Truperellapyogenes)關(guān)系密切，病例中也常分離到大腸桿菌(Escherichiacoli)、壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)、產(chǎn)黑素普氏菌(Prevotellamelaninogenica)、擬桿菌(Bacteroidesspp)等；而健康奶牛在產(chǎn)后10 d內(nèi)，從奶牛子宮中分離率最高的細(xì)菌種類是鏈球菌屬(Streptococcusspp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)和芽胞桿菌屬(Bacillusspp.)，這些菌種的出現(xiàn)，通常不會(huì)引起奶牛發(fā)生具有明顯臨床癥狀的產(chǎn)后子宮疾病[14]。

大量研究表明，采用助產(chǎn)方法會(huì)導(dǎo)致母牛受胎率降低、凍精使用量增加、空懷時(shí)間增加和首次配種時(shí)間后移等繁殖問題[15-16]。推測與子宮內(nèi)菌群的改變、子宮免疫屏障的損傷有關(guān)，但具體機(jī)制尚未闡述清楚。本研究以助產(chǎn)和非助產(chǎn)奶牛為研究對(duì)象，通過子宮灌洗液細(xì)菌的分離培養(yǎng)、16S rRNA測序等方法，以期從細(xì)菌學(xué)角度，分析助產(chǎn)導(dǎo)致繁殖和生產(chǎn)性能降低的原因，為牧場產(chǎn)房和新產(chǎn)牛管理提供指導(dǎo)性的建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 根據(jù)產(chǎn)犢難易程度分為1～4級(jí)：1級(jí)為順產(chǎn)，2級(jí)為牽拉助產(chǎn)，3級(jí)為器械助產(chǎn)，4級(jí)為剖腹產(chǎn)。產(chǎn)犢難度評(píng)分1的為順產(chǎn)(非助產(chǎn))，產(chǎn)犢難度評(píng)分2～4的為難產(chǎn)(助產(chǎn))。

本試驗(yàn)在2021年挑選無產(chǎn)道撕裂、陰道、宮頸損傷、剖宮產(chǎn)史、患子宮炎、子宮內(nèi)膜炎、子宮積膿、胎衣不下、乳房炎等產(chǎn)科疾病，無酮病、蹄病、真胃變位等常見疾病，且體溫低于39.5 ℃的奶牛。記錄牛號(hào)、產(chǎn)犢時(shí)間、是否助產(chǎn)以及用藥等情況。奶牛產(chǎn)犢后45 d，剔除因疾病接受藥物治療的奶牛。根據(jù)有無助產(chǎn)的情況，隨機(jī)采集4份助產(chǎn)(產(chǎn)犢評(píng)分3分)和3份非助產(chǎn)(產(chǎn)犢評(píng)分1分)奶牛的子宮灌洗液樣本，放入裝有冰袋的保溫箱，立即送回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 無菌生理鹽水、綿羊血瓊脂平板、LB培養(yǎng)基，青島科源生物科技有限公司產(chǎn)品；2×Taq Starmix、DNA ladder 2 000，大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 普通生物顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；PCR儀，Bio-RAD公司產(chǎn)品，細(xì)菌培養(yǎng)恒溫?fù)u床，上海智誠分析儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，syngene公司產(chǎn)品；微量加樣槍，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 奶牛子宮灌洗液的采集 隨機(jī)選取助產(chǎn)奶牛和非助產(chǎn)奶牛，在產(chǎn)后45 d利用無菌的子宮沖洗液導(dǎo)管進(jìn)行子宮灌洗液采集。奶牛保定完全后，消毒奶牛陰門，經(jīng)直腸把握子宮頸后，將套有輸精槍外套的子宮沖洗導(dǎo)管經(jīng)奶牛陰門伸入到子宮頸，隔絕產(chǎn)道污染。當(dāng)導(dǎo)管尖端到達(dá)子宮后，去掉輸精槍外套，導(dǎo)管注入空氣進(jìn)行固定，拔出探針后，經(jīng)導(dǎo)管口注入50 mL無菌生理鹽水，經(jīng)直腸按摩子宮后，回抽子宮灌洗液。將獲得的灌洗液快速無菌轉(zhuǎn)入到50 mL離心管，放入裝有冰袋的保溫箱，立即送回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將子宮灌洗液顛倒混勻后，用無菌棉棒蘸取灌洗液，均勻地涂布于血瓊脂平板，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)16～24 h后，觀察血平板細(xì)菌菌落形態(tài)，選擇形態(tài)單一的菌落，繼續(xù)在LB瓊脂平板上劃線純化培養(yǎng)，選取單菌落進(jìn)行鏡檢，確定純度后接種于LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，保存菌種后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 16S rRNA測序 利用上述培養(yǎng)的細(xì)菌為模板，進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增16S rRNA。引物序列：F-5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、R-5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，預(yù)期克隆片段長度為1 492 bp；PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2 ×Taq Starmix，上、下游引物各0.5 μL，1.0 μL模板，10.5 μL ddH2O。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃，30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果后，剩余產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，確定細(xì)菌種屬。

2 結(jié) 果

2.1 沖洗液培養(yǎng)結(jié)果

4份助產(chǎn)(產(chǎn)犢評(píng)分3分)和3份非助產(chǎn)(產(chǎn)犢評(píng)分1分)奶牛子宮灌洗液樣本，經(jīng)血瓊脂平板分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示助產(chǎn)組分離出14株細(xì)菌，非助產(chǎn)組分離出6株細(xì)菌，其中，有9株細(xì)菌有溶血環(huán)，11株無溶血環(huán)。按鏡檢結(jié)果及血平板形態(tài)，革蘭陽性菌的主要為氣球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌和鏈球菌，革蘭陰性菌以腸桿菌屬為主。氣球菌菌落主要為乳白、針尖大小，圓形，α溶血；葡萄球菌菌落直徑1～3 mm，乳白色或黃色，不透明，邊緣整齊，不溶血；棒狀桿菌菌落直徑1～2 mm，乳白色，不溶血；鏈球菌在血瓊脂平板上菌落光滑，乳白色，α溶血。革蘭陰性桿菌腸桿菌菌落邊緣整齊，圓形，乳白色，直徑3～5 mm，α溶血或不溶血。

2.2 16S rRNA測序結(jié)果及分析

對(duì)分離得到的20株微生物進(jìn)行16S rRNA測序。經(jīng)PCR檢測，各株細(xì)菌均能擴(kuò)增出陽性條帶，大小為1 492 bp，符合預(yù)期，部分菌株的電泳結(jié)果見圖1。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～14.細(xì)菌菌株M. DNA marker; 1-14. Bacteria strains圖1 部分細(xì)菌16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of 16S rRNA PCR products of some bacteria

測序結(jié)果經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示共分離到10個(gè)屬的細(xì)菌，包括棒狀桿菌屬、氣球菌屬、志賀菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬等10個(gè)細(xì)菌屬，12種細(xì)菌組成，詳見表1。

其中，非助產(chǎn)奶牛子宮沖洗液分離出鏈霉菌屬(16.67%)、鏈球菌屬(16.67%)、腸桿菌屬(33.33%)、葡萄球菌屬(16.67%)、氣球菌屬(16.67%)5個(gè)屬的細(xì)菌，分別為吖啶霉素鏈霉菌、多動(dòng)物鏈球菌、費(fèi)格森埃希菌、沃氏葡萄球菌、脲氣球菌，見表2。

助產(chǎn)奶牛子宮沖洗液分離出志賀菌屬(7.14%)、不動(dòng)桿菌屬(7.14%)、氣球菌屬(28.58%)、假單胞菌屬(7.14%)、棒狀桿菌屬(21.43%)、芽胞桿菌屬(7.14%)、腸桿菌屬(7.14%)、葡萄球菌屬(7.14%)、鏈球菌屬(7.14%)9個(gè)屬的細(xì)菌，共10種細(xì)菌，分別為宋內(nèi)氏志賀菌、不動(dòng)桿菌、綠色氣球菌、脲氣球菌、摩氏假單胞菌、銀色棒狀桿菌、地衣芽胞桿菌、費(fèi)格森埃希菌、表皮葡萄球菌、多動(dòng)物鏈球菌，詳見表3。

表1 子宮沖洗液分離鑒定微生物結(jié)果

表2 非助產(chǎn)奶牛子宮沖洗液微生物分離鑒定結(jié)果

表3 助產(chǎn)奶牛子宮沖洗液微生物分離鑒定結(jié)果

3 討 論

大量研究表明，奶牛正常子宮內(nèi)并非無菌，而是由特定的需氧、兼性厭氧和專性厭氧微生物群組成[3，17]。產(chǎn)后2周內(nèi)，90%以上的奶牛子宮內(nèi)受到不同程度的細(xì)菌污染[18]，在之后的45 d內(nèi)，大多數(shù)的污染會(huì)被子宮清除，但仍會(huì)有10%左右的奶牛子宮內(nèi)存留不同致病菌，這主要是由于子宮內(nèi)細(xì)菌種類、產(chǎn)后奶牛飼養(yǎng)管理、免疫狀態(tài)、激素水平等造成，但助產(chǎn)是否影響子宮內(nèi)菌群變化仍未闡述清晰。

奶牛助產(chǎn)是牧場處理難產(chǎn)的常用手段，但助產(chǎn)增加子宮、生殖道的損傷及微生物的污染，導(dǎo)致母牛受胎率降低、凍精使用量增加、空懷時(shí)間增加和首次配種時(shí)間后移等繁殖問題[15-16]，閆明濤[19]發(fā)現(xiàn)難產(chǎn)級(jí)別和產(chǎn)后疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)正相關(guān)，且產(chǎn)后疾病對(duì)21 d懷孕率影響顯著，輔助分娩的奶牛更容易感染壞死梭狀芽胞桿菌和化膿性鏈球菌[20-21]。在本研究中，作者以助產(chǎn)和非助產(chǎn)奶牛為研究對(duì)象，分離培養(yǎng)母牛分娩45 d后的子宮灌洗液。結(jié)果表明，非助產(chǎn)奶牛分離出鏈霉菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬、氣球菌屬等5個(gè)屬的細(xì)菌，助產(chǎn)奶牛分離出志賀氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、芽胞桿菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬、氣球菌屬等9個(gè)屬的細(xì)菌。在種的水平上，助產(chǎn)組奶牛增加了宋內(nèi)氏志賀菌、不動(dòng)桿菌、綠色氣球菌、摩氏假單胞菌、銀色棒狀桿菌、地衣芽胞桿菌和表皮葡萄球菌。助產(chǎn)組奶牛子宮內(nèi)微生物多樣性明顯多于非助產(chǎn)組。但據(jù)文獻(xiàn)估計(jì)，實(shí)驗(yàn)室中可培養(yǎng)的細(xì)菌不到1%[22]，因此推斷實(shí)際的助產(chǎn)組奶牛子宮中生物多樣性更加顯著。人們普遍認(rèn)為健康動(dòng)物的子宮在妊娠期間處于無菌狀態(tài)，而產(chǎn)后子宮極易受到細(xì)菌的污染[23]。這主要是由于產(chǎn)中及產(chǎn)后陰門、陰道和子宮頸口的擴(kuò)張，利于細(xì)菌的入侵，加之產(chǎn)后初期子宮內(nèi)營養(yǎng)物和溫度適合細(xì)菌的生長，為侵入細(xì)菌的繁殖提供了適宜的條件。正常情況下，機(jī)體依靠自身的防御機(jī)能，能夠?qū)⒆訉m內(nèi)的污染自動(dòng)清除；如果機(jī)體自身體質(zhì)弱、防御系統(tǒng)不健全，特別是助產(chǎn)引起生殖道損傷及污染，造成致病菌凈化困難，致使病原菌的大量繁殖。在難產(chǎn)引起的損失中，因繁殖問題引起的損失占比達(dá)30%[24]。助產(chǎn)導(dǎo)致嚴(yán)重的繁殖問題，主要是由于助產(chǎn)造成損傷及子宮內(nèi)菌群多樣性增多，引起子宮內(nèi)膜組織復(fù)舊時(shí)間延長等。此外，細(xì)菌產(chǎn)物或炎癥產(chǎn)物可抑制垂體促黃體素的分泌，干擾產(chǎn)后卵巢的功能和卵泡的生長，中斷排卵，從而影響卵巢排卵的正常周期[24]。因此提示，助產(chǎn)造成的子宮微生物多樣性增加，導(dǎo)致其產(chǎn)物引起生殖激素分泌失衡、子宮內(nèi)膜及卵巢功能紊亂，致使奶牛妊娠率降低，配種次數(shù)增加等問題[25]。

綜上所述，助產(chǎn)和非助產(chǎn)奶牛子宮菌群差異顯著，助產(chǎn)導(dǎo)致子宮內(nèi)菌群多樣性增加。產(chǎn)后子宮內(nèi)持續(xù)性的細(xì)菌存在，是造成助產(chǎn)奶牛繁殖問題的原因之一，而其中的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

助產(chǎn)能夠造成奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)長時(shí)間的菌群多樣性增加。