清熱退黃灌腸方對(duì)新生兒黃疸代謝標(biāo)志物的影響及其作用機(jī)制*

馬圓圓，顏佳佳，阮為勇△，步偉全，蘇 婕

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省宿遷市中醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800)

新生兒黃疸是新生兒時(shí)期的常見癥狀，是因?yàn)槟懠t素代謝異常引起血中膽紅素水平升高而導(dǎo)致皮膚、鞏膜及黏膜黃染。新生兒黃疸《活幼新書》中稱為“胎黃”、在《諸病源候論》中述為“胎疸”，其病機(jī)多為濕熱郁蒸，臨床上經(jīng)過系統(tǒng)辨證后，論治用清熱利濕退黃，包括中藥或中成藥口服[1-2]，如茵梔黃口服液、茵陳蒿湯加減；灌腸[3]的中藥湯劑如茵陳蒿湯或各專家自擬湯劑；泡浴[4-5]、辨證推拿[6]、推拿四法[7]、新生兒撫觸[8]等。多篇已發(fā)表的文獻(xiàn)已經(jīng)論證，中藥灌腸、泡浴等中醫(yī)外治法直接跳過了新生兒服藥困難的問題，安全、毒副作用較小，在此病的治療中得到廣泛的應(yīng)用[9]。既往已有多名學(xué)者已經(jīng)證實(shí)了灌腸方法對(duì)新生兒黃疸的療效確切，且本院也在清熱退黃灌腸方治療新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)療效做過相關(guān)研究[10]、發(fā)表過相關(guān)論文[11]，在有效結(jié)論的基礎(chǔ)上，旨在采用代謝組學(xué)的方法，篩選出治療前后血漿差異代謝物，探究灌腸法可能的作用機(jī)制。且前期本課題組已用同樣的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)比黃疸兒與健康新生兒2組間血漿代謝物的差異，初步闡釋了新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)的代謝方面的紊亂，為本試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來源 本課題入組的20例新生兒是因病理性黃疸在本院NICU住院治療的足月兒，病例收集時(shí)間為：2020年05月至2021年1月。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照汪受傳，虞堅(jiān)爾主編的《中醫(yī)兒科學(xué)》[12]中“胎黃”濕熱郁蒸證。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用新生兒學(xué)》[13]中新生兒病理性黃疸章節(jié)。隨機(jī)將20例患兒分為治療組、對(duì)照組各10例，其一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本試驗(yàn)經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)者(批件號(hào)：2019LWKYZ004)，患兒家長(zhǎng)知情同意并簽署同意書。

1.1.2 治療方法 對(duì)照組：根據(jù)病情所需，間斷藍(lán)光治療(浙江戴維醫(yī)療器械有限公司藍(lán)光治療箱)；雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(0.5 g po tid，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè))、魯米那片(5 mg/kg·d，po tid，上海醫(yī)藥有限公司信宜制藥)。治療組：對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上，予以本試驗(yàn)的清熱退黃方灌腸。灌腸方草藥來自本院中藥房，成分具體如下：茵陳蒿9 g，大黃1 g，梔子5 g，雞內(nèi)金8 g，黃柏3 g，茯苓5 g，丹參6 g，在本院制劑室煎熬至40 mL左右，待溫度降至37～40 ℃。新生兒先行清潔灌腸，繼而予5 mL/kg的灌腸方每日1次，連續(xù)使用5 d。

1.1.3 樣本采集 2組患兒均在治療前后分別采集血樣送檢，采全血2 mL于抗凝管內(nèi)，進(jìn)行血漿分離：3000 rpm室溫離心10 min，取上層樣本0.2 mL，裝在1.5 mL容量的離心管中。-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1.1 代謝物的提取 ①取0.1 mL冷凍保存的樣本置于eppendorf管中，加入0.4 mL的80%甲醇水溶液。②離心。③取少許上清加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%。④重復(fù)1次離心，收集上清，進(jìn)樣 LC-MS 進(jìn)行分析。⑤從每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中取等量液體混勻作為QC樣本。

1.2.1.2 色譜分析 色譜柱：HypesilGoldcolumn(C18)；Column temperature：40 ℃；flow rate：0.2 mL/min；正模式：流動(dòng)相A：0.1%甲酸，負(fù)模式：pH9.0，流動(dòng)相A：5 mM醋酸銨；流動(dòng)相B均為：甲醇。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.2.1.3 質(zhì)譜方法 掃描范圍選擇 m/z 100～1500；ESI源的設(shè)置如下：電噴霧電壓：3.2 kV；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：10 arb；Capillary Temp：320 ℃；極性：正或負(fù)；MS/MS二級(jí)掃描為data-dependent scans.

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析 對(duì)質(zhì)譜分析原數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理、基線濾波、峰識(shí)別對(duì)齊、積分、保留時(shí)間校正，獲得所需的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰強(qiáng)的數(shù)據(jù)矩陣。因?yàn)槊糠N標(biāo)志物在液相色譜、質(zhì)譜條件下均有其表現(xiàn)形式，故和大數(shù)據(jù)庫、標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)后，最終確定生物標(biāo)志物。采用歸一化數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析：主成分分析PCS、正交偏最小二乘判別法OPLS-DA分析。后者則將多變量、單變量?jī)煞N方法相結(jié)合，篩選出差異代謝物。結(jié)合HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫再篩選一次，后對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，研究對(duì)比2組治療后、治療組治療前后差異代謝物參與的最主要生化代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，開展通路功能的研究。

2 結(jié)果

2.1 治療組差異代謝物篩選 進(jìn)行OPLS-DA建模后，對(duì)模型中VIP≥1 且 T-testP<0.05進(jìn)行差異代謝物篩選，數(shù)據(jù)歸一化后進(jìn)行聚類分析，再結(jié)合人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫、京都基因和基因組百科全書進(jìn)一步匹配注釋獲得代謝物準(zhǔn)確信息，共篩選出差異代謝物17種。與治療前所有樣本相比，治療組治療后α-酮戊二酸等11種代謝物上調(diào)，肌酸酐等6種代謝物下調(diào)，見表2。

表2 治療組治療后與所有樣本治療前差異代謝物

2.2 治療組治療前后差異代謝物代謝通路分析 將所找到的差異代謝物通過KEGG通路富集，且超幾何檢驗(yàn)P值小于0.05，共找到6種可能的代謝通路，為三羧酸循環(huán)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、賴氨酸生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、膽堿能突觸。

2.3 治療后治療組與對(duì)照組差異代謝物篩選 通過同樣的方法，治療后治療組與對(duì)照組共篩選出差異代謝物15種。與對(duì)照組相比，治療組中N-乙酰-L-天冬氨酸等10種代謝物上調(diào)，肌酸酐等5種代謝物下調(diào)，見表3。

表3 治療后治療組與對(duì)照組差異代謝物

2.4 治療后對(duì)照組與治療組對(duì)比代謝通路分析 用同樣的方法，共找到3條可能的代謝通路，為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、膽堿能突觸丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。

2.5 結(jié)果分析 治療組治療前后篩選出差異的代謝物17種，主要涉及氨基酸代謝、能量代謝等。代謝通路有6種，涉及的代謝物α-酮戊二酸、1-甲基組氨酸、膽堿等含量均較治療前上調(diào)。治療后治療組與對(duì)照組篩選出差異代謝物15種，同樣為涉及氨基酸代謝、能量代謝。代謝通路有3種，涉及的差異代謝物α-酮戊二酸、L-谷氨酸、膽堿等含量均為上調(diào)。說明中藥灌腸聯(lián)合西醫(yī)治療新生兒黃疸能夠促進(jìn)氨基酸及能量合成、調(diào)節(jié)膽堿能通路，對(duì)黃疸患兒所發(fā)生的代謝紊亂起到調(diào)節(jié)作用。推測(cè)其因，可能與中藥灌腸藥調(diào)整患兒胃腸功能有聯(lián)系，使對(duì)其氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強(qiáng)有關(guān)[14]。此外，膽堿能通路具有刺激胃腸蠕動(dòng)功能[15]，可使患兒納乳增加，增加能量轉(zhuǎn)化來源，從而增強(qiáng)抗病能力。

3 討論

目前對(duì)于新生兒黃疸中醫(yī)治療方案眾多，常用的口服有茵梔黃口服液、清熱利濕祛黃類的中藥湯劑，外治法有中藥洗浴、中藥灌腸、推拿、穴位按摩等，均取得了一定的療效，相關(guān)療效類研究及文章較多。但對(duì)于中醫(yī)藥治療新生兒黃疸的代謝組學(xué)研究、中醫(yī)藥的治療機(jī)制，文章及相關(guān)成果卻較為稀少。代謝組學(xué)是一個(gè)目前研究較少的領(lǐng)域，它能測(cè)定多種小分子的濃度，并且適用于幾乎所有的生物基質(zhì)，例如血液、腦脊液、尿液和組織。由于測(cè)定的是各種生理和病理過程的代謝最終產(chǎn)物，故代謝組學(xué)有可能提供基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域無法收集到的信息。代謝組學(xué)可實(shí)現(xiàn)從微觀角度對(duì)清熱退黃灌腸方治療新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)作用機(jī)制進(jìn)行解析，為中醫(yī)藥治療新生兒黃疸研究提供借鑒，也可以為新生兒黃疸的辨證、治療等提供新的技術(shù)，值得推廣和應(yīng)用。但本研究病例收集的樣本量有限，個(gè)體差異造成的影響暫不能排除，仍需進(jìn)一步大樣本的驗(yàn)證。同時(shí)，其他容易獲得的標(biāo)本如尿液，也可以用本試驗(yàn)的方法，對(duì)比尿液治療前后代謝組學(xué)的差異，對(duì)比尿液治療組與對(duì)照組代謝組學(xué)的差異，來驗(yàn)證血漿代謝組學(xué)所得到的結(jié)論是否正確，本課題組也將對(duì)尿液代謝組學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期對(duì)新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)的代謝組學(xué)的研究更加的完善、準(zhǔn)確。