HPLC法測(cè)定女貞子中三種黃酮類成分的含量*

李 蓉，林艾和，夏宗霄，龍小妹，郭 爽，范 源，2△

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216)

女貞子為木犀科(Oleaceae)植物女貞(LigustrumLucidumAit.)的干燥成熟果實(shí)，是我國傳統(tǒng)中藥，分布于華南、華東、西南及華中各地，主產(chǎn)于浙江、江蘇、湖南等地[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，女貞子含有黃酮類、三萜類等多種化學(xué)成分及多種微量元素[2-3]；現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤抗癌等作用，其毒副作用較低[4]。黃酮類化合物分為黃酮類、二氫黃酮類、異黃酮類、黃酮醇類、查耳酮類、花青素類、橙酮類、雙黃酮類以及黃烷醇類等類型，木犀草素和芹菜素為黃酮類，廣泛分布于維管束植物中；槲皮素為黃酮醇類，主要分布于雙子葉植物特別是木本植物中[5]。諸多文獻(xiàn)研究顯示，黃酮類化合物具有抗胃潰瘍、神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血，抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用[6]。一直以來，在藥物研發(fā)領(lǐng)域備受關(guān)注。黃酮類化合物是女貞屬中最常見的化學(xué)成分，也是女貞子中具有降脂作用最主要的成分，總有效率達(dá)91.3%，女貞總黃酮可較好的調(diào)節(jié)高血脂模型大鼠的脂代謝紊亂[7]。芹菜素屬于黃酮類成分，其中卷柏、芫花中含量最高，其內(nèi)在毒性低，治療各種炎癥；且在殺死癌細(xì)胞方面顯示出極好的效果[8]，木犀草素作為一種天然黃酮類化合物其抗腫瘤的發(fā)展?jié)摿薮骩9]。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，能致突變，可以被機(jī)體吸收且經(jīng)代謝后無毒性，因此具有巨大的臨床應(yīng)用潛力[10-12]。中藥材的有效成分滲出受提取溶劑體積影響，確定提取溶劑體積有利于目標(biāo)成分高效快速的被提取，且有利于穩(wěn)定臨床療效。本實(shí)驗(yàn)通過考察4個(gè)不同料液比對(duì)女貞子中黃酮類成分的影響，為女貞子黃酮類成分的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī)，永康式速鋒工貿(mào)有限公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀，Agilent Zorbax C18 鍵合硅膠柱(150×4.6 mm，5 μm)，美國Agilent公司；上海量壹科學(xué)儀器有限公司；YL-040S語路超聲波清洗機(jī)，深圳市即潔超聲科技有限公司；D2KW-D電熱恒溫水浴鍋。AB265-S十萬分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade(Shanghai)Co.LTD。

1.1.2 試劑 槲皮素(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)C01J10Y91727，HPLC≥98%)，木犀草素(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)C29N10Q104574，HPLC≥98%)，芹菜素(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)T30A11F112008，HPLC≥98%)，女貞子產(chǎn)于云南昆明；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax C18(250×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：365 nm；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水，洗脫程序見表1，色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 女貞子中槲皮素、木犀草素和芹菜素HPLC圖

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素、芹菜素、木犀草素對(duì)照品粉末各2.63 mg，2.39 mg，2.32 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容配置成0.1052、0.0956、0.0928 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取干燥的女貞子，粉碎，過篩，精密稱取5 g女貞子粉末，置于圓底燒瓶中，分別加80%的乙醇100 mL，加熱回流提取120 min，取全部過濾所得續(xù)濾液，60 ℃減壓回收至膏狀，加甲醇溶解移至10 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，將續(xù)濾液移至高效液相進(jìn)樣小瓶中即得。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的各對(duì)照品溶液，等體積混合后過0.45 μm微孔濾膜，依次精密吸取2、4、6、8、10、12 μL混合對(duì)照品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣；以槲皮素、木犀草素、芹菜素的各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2，可得各成分在線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄所測(cè)得各化合物的峰面積，計(jì)算所得槲皮素、木犀草素、芹菜素的RSD值分別為0.17%、0.20%、0.28%，表明該儀器的精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將制備所得的供試品溶液過0.45 μm微孔濾膜，室溫放置0、2、4、6、8、10 h，精密吸取10 μL，于“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算所得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面積RSD值分別為3.09%、1.74%、0.85%，表明該方法制備所得的供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 制備6份供試品溶液過0.45 μm微孔濾膜，分別精密吸取供試品溶液10 μL，于“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算所得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面積RSD值分別為2.78%、2.20%、0.77%，表明該方法制備的供試品溶液重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 稱取6份女貞子樣品，每份約5.0 g，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，加入槲皮素、木犀草素和芹菜素對(duì)照品適量(相當(dāng)于5.0 g女貞子中所含的槲皮素、木犀草素和芹菜素的量)，再按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)

3 討論

諸多文獻(xiàn)對(duì)女貞子萜類化合物研究的報(bào)道較多，而黃酮類成分也極為豐富，如槲皮素、木犀草素、芹菜素等，具有較高的藥用價(jià)值[13]。黃酮類化合物一般難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。故本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取樣品，分別采用甲醇、乙醇進(jìn)行提取，結(jié)果表明，采用乙醇作為提取溶劑時(shí)，槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量較高。

預(yù)實(shí)驗(yàn)分別以甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，當(dāng)采用甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，進(jìn)行梯度洗脫，三個(gè)目標(biāo)峰峰形較好，分離度較好，且拖尾峰峰形得到明顯改善，故選用甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。同時(shí)還對(duì)柱溫(25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示柱溫30 ℃時(shí)分離度較好。

目前大多數(shù)研究者對(duì)女貞子黃酮類成分的研究多集中在總黃酮，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量，方法簡便、易行、準(zhǔn)確度高，可為女貞子黃酮類成分的質(zhì)控研究提供參考。