徐志媛，李杰峰，孫艷玲，3，趙澤廣，楊威，徐麗娜，張寧★

（1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071001；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；3.河北農(nóng)業(yè)大學，河北 保定 071001）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）是一種革蘭氏陰性桿菌，對多種動物和人都具有致病性錯誤，根據(jù)莢膜抗原的差別可分為A、B、D、E和F，5個血清型。巴氏桿菌病的發(fā)病率在30%～70%之間錯誤！未找到引用源。，可感染豬、牛、雞、鴨，兔等家畜的上呼吸道錯誤，可引起豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥，禽霍亂等錯誤。近年來，巴氏桿菌病在國內(nèi)外廣泛流行，危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展錯誤。2021年8月，河北保定某豬場的育肥豬發(fā)生一種以呼吸困難及后肢站立困難為主要癥狀的疫病。對分離菌株進行藥敏試驗和耐藥基因檢測，以期為該場對多殺性巴氏桿菌病的防治、臨床用藥、降低細菌耐藥性等提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病料病料來源于河北省保定市某養(yǎng)豬場發(fā)病豬肺臟樣本。

1.2 試驗試劑與培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、哥倫比亞血板、生化反應管購自青島海博生物科技有限公司。濁度管購自比克曼生物科技有限公司。藥敏紙購自杭州微生物試劑有限公司?；蚪MDNA快速提取試劑盒購自Tiagen生化科技有限公司。M5 DL2000 DNA Maker、M5 DNA電泳瓊脂糖、2×M5 HiPer HiFi PCR Mix購自北京保利美生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細菌的分離培養(yǎng)無菌剪取肺臟組織放入裝有500μL生理鹽水的離心管中，研磨后短暫離心，取上清液，加入TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。將TSB細菌培養(yǎng)液接種于血平板后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑取單個菌落接種于哥倫比亞血平板、麥康凱培養(yǎng)基、血平板上，觀察菌落形態(tài)、大小、溶血情況等，挑取單菌落進行瑞氏-姬姆薩染色、革蘭氏染色、莢膜染色。

2.2 PCR鑒定與分型

2.2.1 引物設計參照文獻設計巴氏桿菌PCR鑒定、分型引物，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，引物信息（見表1）。

表1 巴氏桿菌鑒定與分型引物信息

2.2.2 反應體系及反應條件提取細菌基因組作DNA模板，進行PCR反應。巴氏桿菌鑒定及分型反應體系均為20μL：2×EsTaq Master Mix 10μL，ddH2O 8μL，DNA模板2μL。巴氏桿菌鑒定反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。分型鑒定反應條件：95℃預變性10min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

2.3 生化試驗將純培養(yǎng)的菌液接種于微量生化反應管后，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察并記錄結(jié)果。

2.4 動力實驗用接種針挑取純化培養(yǎng)后的單菌落，垂直從半固體培養(yǎng)基表面插入，于37℃培養(yǎng)24h，觀察穿刺線上細菌生長的變化。

2.5 藥敏試驗將菌液濃度調(diào)整至1.5×108CFU/mL，參考美國臨床和實驗室標準化協(xié)會抗微生物藥物敏感試驗標準M100S26th，進行藥敏試驗、判定結(jié)果。

2.6 耐藥基因檢測根據(jù)文獻選取β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類等4類耐藥基因進行檢測，引物信息（見表2）。PCR反應體系同“2.2.2”，退火溫度如表2所示，將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

表2 耐藥基因引物信息

3 結(jié)果

3.1 細菌的分離分離菌于麥康凱培養(yǎng)基及哥倫比亞血平板上未生長，在血平板上，形成圓形微突起、灰白色、表面光滑、半透明、濕潤、不溶血的露珠樣菌落（圖1A）；瑞氏-姬姆薩染色可見兩極濃染的小桿菌（圖1B）；革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陰性、單個或成對存在、兩端鈍圓的短桿菌（圖1C）；莢膜染色可見紫色菌體周圍有明亮的透明圈（圖1D）。

圖1 細菌形態(tài)

3.2 PCR鑒定與分型分離菌種屬特異性鑒定，PCR擴增出現(xiàn)約460bp的特異性條帶（圖2），與目的條帶一致，證實分離到的菌株為多殺性巴氏桿菌。分離出的多殺性巴氏桿菌莢膜分型鑒定結(jié)果（圖3）顯示，僅莢膜A型出現(xiàn)與目的條帶相符的條帶，證明分離的多殺性巴氏桿菌為莢膜A型多殺性巴氏桿菌。

圖2 KMT1 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖M：DNA分子質(zhì)量標準；1：樣品。

圖3 莢膜分型凝膠電泳結(jié)果M：DNA分子質(zhì)量標準；A、B、D、E、F：樣本。

3.3 生化試驗生化鑒定結(jié)果（見表3），該菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、木糖、山梨醇、甘露醇，不能夠分解海藻糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖。氧化酶，靛基試驗為陽性，VP-MR試驗為陰性，符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。

表3 分離菌株生化鑒定結(jié)果

3.4 動力試驗動力試驗為陰性，穿刺線上沒有明顯的細菌擴散生長痕跡。

3.5 藥敏試驗藥敏試驗結(jié)果（見表4），該菌株對氨芐西林、頭孢克洛、頭孢克肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、頭孢曲松、頭孢噻肟、丁胺卡那、阿奇霉素敏感，對鏈霉素耐藥。

表4 分離菌的藥敏試驗結(jié)果

3.6 耐藥基因檢測結(jié)果（見圖4），氨基糖苷類耐藥基因aadA1檢測為陽性，該分離株攜帶aadA1耐藥基因，其他耐藥基因未檢出。

圖4 耐藥基因的鑒定M：DNA分子質(zhì)量標準；1：aadA1耐藥基因；2：陰性。

4 討論

多殺性巴氏桿菌在豬群中屬于條件性致病菌，常與多種病原發(fā)生混合感染，從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率，造成極大的經(jīng)濟損失。多殺性巴氏桿菌宿主特異性低，可以在豬、雞等多種動物之間傳播，因此，研究不同宿主源多殺性巴氏桿菌的病原及其耐藥性，有助于對多殺性巴氏桿菌病的防治。

莢膜是位于細胞壁表面的一層松散的黏液物質(zhì)，在多殺性巴氏桿菌逃避宿主先天免疫的過程中發(fā)揮著重要作用，根據(jù)莢膜抗原的差別可將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E和F等5個血清型。莢膜A型多殺性巴氏桿菌常引起豬的肺部感染導致肺炎，B型菌株能引起豬的出血性敗血癥，D型菌株導致豬萎縮性鼻炎，在豬群中未見E型分離的報道，F(xiàn)型巴氏桿菌報道非常少見，方超等從豬中分離出了F型巴氏桿菌，但其對豬群的致病機制目前還不清楚。Emily Smith等人研究發(fā)現(xiàn)，豬源分離株中，莢膜血清型A(66.7%)最常見，其次是莢膜血清型D(19.0%)、F(9.5%)和B(4.8%)。多殺性巴氏桿菌的流行表現(xiàn)出一定的“宿主偏好性”。莢膜A型和D型多殺性巴氏桿菌主要在豬中流行，B型和E型主要在牛中流行，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌主要在家禽和野鳥中流行。分離株被鑒定為莢膜A型，與我國豬多殺性巴氏桿菌莢膜A型和D型為優(yōu)勢基因型的結(jié)果一致。

細菌耐藥性的產(chǎn)生是一個復雜的過程，耐藥機制大體可分為固有性耐藥和獲得性耐藥兩種，多殺性巴氏桿菌的耐藥與靶基因突變、質(zhì)粒介導、細胞膜通透性改變、外排泵的過量表達等因素有關(guān)。本試驗選用12種臨床常用抗生素對分離菌株進行藥敏試驗。結(jié)果表明，分離菌對鏈霉素表現(xiàn)耐藥，與胡璇等報道的豬源莢膜A型多殺性巴氏桿菌對青霉素及頭孢曲松等5種藥物耐藥的結(jié)果不同。胡星星等研究發(fā)現(xiàn)2017年我國豬源多殺性巴氏桿菌對鏈霉素的耐藥率達到43.64%，對卡那霉素的耐藥率達到52.73%，這表明其對氨基糖苷類藥物的耐藥率相對較高。因為多殺性巴氏桿菌質(zhì)?；蛉旧w上攜帶多種氨基糖苷類鈍化酶基因，所以巴氏桿菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥。Corinna Keherenberg等對德國分離的3株多殺性巴氏桿菌進行耐藥基因檢測，檢出編碼修飾鏈霉素鈍化基因strA和strB。本次試驗檢測出分離菌攜帶氨基糖苷類耐藥基因aadA1。與王喜等人報道的分離菌株含有sul2和tetB兩種耐藥基因，及胡璇等報道的分離菌攜帶cml、tem，gyrB三種耐藥基因不同，因宿主源、地區(qū)的不同多殺性巴氏桿菌之間的耐藥性會存在較大差異。

由于藥物的不合理使用，多殺性巴氏桿菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，使養(yǎng)殖場對該種病原的防控工作越來越困難。抗生素耐藥最根本的解決辦法是減少抗生素的使用，從而建立快速檢測MIC和耐藥基因的方法，建立耐藥細菌數(shù)據(jù)庫，根據(jù)選擇抗生素耐藥基因、耐藥機制，從而減少藥物濫用，建立合理的給藥方案，能在保證安全性的同時提高藥物的有效性。

5 結(jié)論

本試驗從保定某豬場病死豬肺臟中分離到1株A型多殺性巴氏桿菌，該菌株對鏈霉素耐藥，攜帶氨基糖苷類耐藥基因aadA1。不同地區(qū)的多殺性巴氏桿菌耐藥性差異比較明顯，在用藥前進行耐藥性分析，有助于提高多殺性巴氏桿菌病的治療效率。