飼料中添加新型金藻對虹鱒幼魚肝臟抗氧化性能的影響

常洪淼，馬淑偉，邱廣文，劉紅柏，韓世成，陸紹霞，王常安，劉洋

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.大連海洋大學，遼寧 大連 116000；3.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214000；4.東北農業(yè)大學動物科技學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

鮭鱒魚類是世界上主要的水產養(yǎng)殖類群，2020年全球養(yǎng)殖產量超過300 萬t[1]。近年來，我國鮭鱒魚類養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展較為迅速，據(jù)2020 年度中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示，年產量已超過4 萬t，其中主要的產量來自虹鱒。虹鱒隸屬于鮭科太平洋鮭屬，是鮭鱒魚類的代表種類，是世界上養(yǎng)殖范圍最廣泛的魚類之一，也是我國鮭鱒魚類的主要養(yǎng)殖種類。虹鱒是典型的冷水性魚類，對生存水質和養(yǎng)殖條件要求較高，在養(yǎng)殖生產中較易受到病害的威脅[2]。國家和消費者對食品安全高度重視，自2020 年7 月1 日起，我國飼料“禁抗令”全面施行，尋求綠色、高效的抗生素替代品和免疫增強劑已成必然趨勢。

微藻種類繁多、營養(yǎng)豐富，易于大規(guī)模定向培養(yǎng)，占耕地面積小，已有多種微藻被廣泛應用于食品、養(yǎng)殖、醫(yī)藥、化妝品等領域[3]。一些含有多糖和生理活性物質的微藻用作水產養(yǎng)殖飼料添加劑，可以提高魚體免疫力、影響抗氧化酶活性、改善魚體健康水平。研究表明，飼料中添加適當比例的小球藻（Chlorella vulgaris）提取物可以顯著提高香魚（Plecoglossus altivelis）的抗應激能力[4]；以添加了巨藻（Macrocystis pyritera）提取物的飼料喂養(yǎng)鮭點石斑魚（Epinephelus coicoides），可顯著提升魚體SOD活性[5]；在飼料中添加5%的鼠尾藻（Sargassum thunbergii）粉可顯著提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼魚的抗氧化能力與非特異性免疫力[6]；在飼料中添加1%與2%的螺旋藻（Spirulina）粉分別提高了尼羅羅非魚[7]（Oreochromis niloticus）與雜交黃顙魚[8]的抗氧化能力以及抗病能力。

機體的抗氧化酶防御體系包含超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）等多種抗氧化酶，在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等發(fā)揮重要作用[9]。SOD 是一種含金屬離子的酶，可以使O2-發(fā)生歧化反應生成H2O2，再在CAT 的作用下分解生成H2O 和O2。GPX 可以與SOD、CAT 協(xié)同作用，清除體內多余自由基，保護機體免受氧化損傷[10]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是機體內氧自由基與多不飽和脂肪酸生成的一種脂質過氧化物，MDA 含量可以反映機體內脂質過氧化的程度與機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[11]。

本實驗在飼料中添加不同比例的富含β-葡聚糖的新型金藻，比較研究其對三倍體虹鱒殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）攻毒前后肝臟抗氧化性能的影響，旨在評價該新型金藻作為虹鱒飼料免疫增強劑的潛力，并為虹鱒的綠色健康養(yǎng)殖提供理論與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗微藻與飼料

實驗用微藻為富含β-葡聚糖（55%）的新型金藻，來自中國科學院水生生物研究所藻類生物技術和生物能源研發(fā)中心。實驗基礎飼料以魚粉、豆粕等為主要蛋白源，以大豆油和魚油作為主要脂肪源，以面粉為主要糖源。所有固體原料混合前粉碎，過40 目篩，采用逐級擴大法預混合。準確稱量兩種油脂，加入到預混好的粉狀物中，充分混勻后擠壓制粒，65℃烘干后裝袋保存于-20℃冰柜中待用。飼料配方見表1。

表1 實驗飼料配方及生化組成（%干重）Tab.1 Ingredients and proximate composition of the experimental diets（% dry matter）

1.2 飼養(yǎng)管理

實驗在中國水產科學研究院黑龍江水產研究所（哈爾濱）循環(huán)水養(yǎng)殖車間進行。養(yǎng)殖系統(tǒng)由30個直徑0.76 m、水深0.25 m，總水體約8 m3的圓柱形培育缸組成。實驗用三倍體虹鱒購自遼寧本溪艾格莫林公司。實驗前投喂山東漢業(yè)產商品飼料4周，暫養(yǎng)馴化，之后使用對照組飼料投喂2 周。選取體格健壯，體質量（10.40±0.13）g 的個體300 尾，放入12 個培育缸中，每缸25 尾，隨機分為4 組，每組3 個重復，分別投喂在基礎飼料中添加0%、2%、4%、8%藻粉的等氮等脂的飼料。試驗期間，每日9:00和16:00 各投喂一次至表觀飽食，水溫為（14±0.5）℃，水流速度控制在0.4 m/s，溶解氧含量大于8 mg/L，pH 為8.5～9.0，光照周期為12L∶12D，每日換水量為水體總體積的15%～20%。實驗周期為8 周。

1.3 攻毒實驗

養(yǎng)殖實驗結束時，每組隨機取魚50 尾，麻醉后腹腔注射濃度為7.2×108CFU/mL 的殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）菌液0.1 mL，統(tǒng)計3 d 與7 d 致死率。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖實驗結束時，實驗魚饑餓24 h 后，從每個養(yǎng)殖缸中隨機取2 尾樣品，采集（每個處理取6 尾）肝臟，并分別于攻毒后第3 d 和第7 d 再次采集各處理組肝臟樣品，每個處理取6 尾。采樣時，用200 mg/L MS-222 麻醉實驗魚，迅速收集肝臟并放入液氮中保存待測。

1.5 樣品分析

肝臟樣品從液氮中取出，置于冰上化凍，加入9倍體積的生理鹽水，在冰浴條件下制成10%組織勻漿，低溫高速離心10 min（4℃，3 500 r/min）,取上清液，將上清液分批稀釋保存后用于后續(xù)測定。

SOD 活性采用WST-1 法測定，CAT 活性采用鉬酸銨法測定，GPX 活性采用比色法測定，MDA 含量采用TBA 法測定，組織蛋白濃度采用考馬斯亮藍法測定。上述測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。具體計算公式如下：

SOD 活性（U/mg prot）=[（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）]/（A對照-A對照空白）/2×反應體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/0.02 mL）/待測樣本蛋白濃度；

CAT 活性（U/mg prot）=（對照ODf-測定OD值）×235.65/（60×取樣量）/待測樣本蛋白濃度；

GPX 活性（μmol/mg prot）=（非酶管OD 值-酶管OD 值）/（標準管OD 值-空白管OD 值）×標準管濃度×5/反應時間/（取樣量×待測樣本蛋白濃度）；

MDA 含量（nmol/mg prot）=（測定OD 值-對照OD 值）/（標準OD 值-空白OD 值）×標準品濃度/待測樣本蛋白濃度；

待測樣本蛋白濃度（mg/mL）=（測定OD 值-空白OD 值）/（標準OD 值-空白OD 值）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)

1.6 數(shù)據(jù)分析

特定生長率和攻毒前后成活率分別按照下列公式計算：

特定生長率（SGR,% d-1）=100×[ln（終末體質量）-ln（初始體質量）]/飼養(yǎng)天數(shù)；

攻毒前死亡率（%）=100×死亡魚數(shù)量/（起始數(shù)量-采樣數(shù)量）；

攻毒后死亡率（%）=100×死亡魚數(shù)量/（起始數(shù)量-采樣數(shù)量）。

特定生長率和抗氧化指標均用平均值±標準誤（Mean±S.E.）表示，應用SPSS 21 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），利用Duncan 檢驗各組間方差同質性，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 攝食添加不同含量金藻飼料對虹鱒幼魚生長與死亡率的影響

各處理組的特定生長率分別為2.74±0.08、2.58±0.08、2.68±0.05、2.43±0.23，其中8%處理組的特定生長率顯著低于對照組（P＜0.05）外，其余各組間無顯著性差異（P＞0.05）。各處理組死亡率均低于3%，組間沒有顯著性差異（P＞0.05）。攻毒3 d 死亡率分別為25%、16%、16%、32%，攻毒7 d 死亡率分別為30%、16%、16%、41%（表2）。

表2 攝食不同實驗飼料對虹鱒幼魚攻毒后死亡率的影響Tab.2 Effects of different experimental diets on mortality after infection of rainbow trout

2.2 攝食添加不同含量金藻飼料對虹鱒肝臟SOD活性的影響

養(yǎng)殖實驗結束時，2%組與4%組虹鱒肝臟SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05），攻毒7 d 后各組間無顯著性差異（P＞0.05）。各組SOD 活性均隨攻毒時間延長呈先升高后降低的趨勢，在攻毒7 d 時顯著低于未攻毒與攻毒3 d 時（P＜0.05）（圖1）。

圖1 攝食不同實驗飼料時三倍體虹鱒肝臟SOD 的活性Fig.1 SOD activity in liver of triploid rainbow trout fed different diets

2.3 攝食添加不同含量金藻飼料對虹鱒肝臟CAT活性的影響

養(yǎng)殖實驗結束時，2%組與4%組虹鱒肝臟CAT活性較對照組均有提高，2%組顯著高于對照組和8%組（P＜0.05），攻毒3 d 時8%組CAT 活性顯著高于其余組（P＜0.05），在攻毒7 d 時各組間無顯著性差異（P＞0.05）。

攻毒3 d 時對照組CAT 活性顯著提高（P＜0.05），2%組在不同時間點并未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），4%組在攻毒7 d 時CAT 活性顯著高于未攻毒時與攻毒3 d 時（P＜0.05）。8%組CAT 活性隨攻毒時間呈先升高后下降的趨勢，在攻毒3 d 時達到最大值，顯著高于未攻毒時與攻毒7 d 時（P＜0.05）（圖2）。

圖2 攝食不同實驗飼料時三倍體虹鱒肝臟CAT 的活性Fig.2 CAT activity in liver of triploid rainbow trout fed different diets

2.4 攝食添加不同含量金藻飼料對虹鱒肝臟GPx活性的影響

養(yǎng)殖實驗結束時，2%組與4%組GPx 活性高于對照組，且2%組顯著高于對照組（P＜0.05），攻毒7 d 時8%組GPx 活性顯著低于其余組（P＜0.05）。對照組與8%組GPx 活性在攻毒7 d 時顯著低于未攻毒組與攻毒組3 d 時（P＜0.05），2%組GPx 活性在攻毒后顯著下降（P＜0.05）（圖3）。

圖3 攝食不同實驗飼料時三倍體虹鱒肝臟GPx 的活性Fig.3 GPx activity in liver of triploid rainbow trout fed different diets

2.5 攝食添加不同含量金藻飼料對虹鱒肝臟MDA含量的影響

養(yǎng)殖實驗結束時，虹鱒肝臟中MDA 含量隨飼料中新型金藻添加量增加呈上升趨勢，4%組與8%組顯著高于對照組（P＜0.05）；攻毒后，8%組肝臟MDA 含量顯著升高，且顯著高于其余組（P＜0.05），而其他各處理組MDA 含量在攻毒前后沒有顯著差異（P＞0.05）（圖4）。

圖4 攝食不同飼料時三倍體虹鱒肝臟MDA 的含量Fig.4 MDA content in liver of triploid rainbow trout fed different diets

3 討論

由于富含氨基酸、不飽和脂肪酸以及多糖等有益成分，多種微藻被用做飼料添加劑改善水產動物的機體健康。飼料中添加一定含量的螺旋藻與裂壺藻均可以提升紅草金魚（Carassius auratus var.red）的非特異性免疫力與機體抗氧化能力[12]；飼料中添加4%～5%的螺旋藻顯著提升了花鱸（Lateolabrax japonicus）的抗氧化能力[13]。以上研究結果均表明，飼料中添加微藻可以通過提升水產動物的非特異性免疫功能、影響抗氧化能力等方式改善機體健康。

β-葡聚糖是葡萄糖單體通過糖苷鍵連接而成的同型多糖，主要以細胞結構成分的形式廣泛存在于細菌、酵母、蘑菇和藻類等生物中，具有提高免疫力與抗氧化性能的作用[14]，可以作為多種水產動物的免疫增強劑，改善水產動物機體健康。研究表明β-葡聚糖可改善亞東鮭（Salmo trutta fario）抗氧化性能，增強機體健康和抗病力[15]；在飼料中添加0.2%β-葡聚糖增強了虹鱒的免疫調節(jié)功能，提高虹鱒感染殺鮭氣單胞菌后的成活率[16,17]。β-葡聚糖可以提高花鱸的非特異性免疫力與抗氧化能力[18]，也可促進齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）的生長及免疫功能[19]。然而，不同來源的β-葡聚糖對動物健康的影響存在一定的差異。對從啤酒酵母、燕麥與猴頭菇中提取的β-葡聚糖進行對比試驗表明，啤酒酵母源β-葡聚糖對小鼠機體抗氧化能力與免疫功能的影響優(yōu)于燕麥與猴頭菇[20]。

本研究中，飼料中添加2%和4%的富含β-葡聚糖的新型金藻顯著地影響了攻毒前后肝臟抗氧化能力，提高了虹鱒抗殺鮭氣單胞菌的能力。經(jīng)過8周的飼養(yǎng)，飼料中添加2%與4%的新型金藻提高了虹鱒肝臟SOD、CAT 和GPx 活性，并受到攻毒時長的影響。這與王永宏[21]的研究結果相近。紀利芹等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，虹鱒感染殺鮭氣單胞菌之后血清MDA含量顯著升高，這說明機體受到一定程度的氧化損傷，而H2O2等過氧化物為機體受到氧化損傷后的產物[23]，因而虹鱒在感染殺鮭氣單胞菌后肝臟CAT 與GPx 活性增強以維持機體穩(wěn)定。SOD、CAT 和GPx是抗氧化酶系的重要組成成員。SOD 是生物體內的一種抗氧化金屬酶。它能夠通過催化超氧陰離子自由基平衡機體的氧化和抗氧化水平，可與CAT 和GPx 協(xié)同作用，清除體內多余的自由基，減輕機體受到的氧化損傷[10]。本研究的結果表明，飼料中適宜比例的新型金藻具有提高虹鱒肝臟抗氧化能力和降低虹鱒感染殺鮭氣單胞菌后死亡率的作用。

MDA 是自由基作用于脂類物質發(fā)生過氧化反應的終產物，可反映機體脂質過氧化程度，具有細胞毒性，也可間接反映出細胞損傷程度。本實驗中，2%組與4%組虹鱒肝臟MDA 含量在攻毒后沒有顯著提高，說明適量的新型金藻添加對虹鱒肝臟的氧化損傷的影響比較有限。但高劑量處理組（8%）虹鱒肝臟MDA 含量顯著高于其他各組，特別是攻毒后MDA 含量大幅度提高，提示殺鮭氣單胞菌感染顯著增加了高含量金藻飼喂虹鱒的肝臟氧化損傷[24]，這可能是該組虹鱒細菌感染后成活率下降的重要原因之一。然而，有研究表明，連續(xù)兩周給鯉（Cyprinus carpio）投喂添加了200 μg/mL β-葡聚糖的飼料，降低了鯉的抗病力[25]，這與其在亞東鮭[15]和花鱸[18]中的研究結果不同，與本實驗中所得結果也有較大差異，提示β-葡聚糖對魚體免疫功能的作用可能受到養(yǎng)殖動物種類和養(yǎng)殖條件的影響。

綜合抗氧化結果、攻毒后死亡率以及添加成本，在虹鱒的飼料中添加2%該新型金藻較為適宜，但該新型金藻用作虹鱒飼料添加劑的具體使用方法以及作用機制仍有待進一步研究。