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      東北碳酸鹽型鹽堿池塘耐(嗜)堿微生物的篩選及功能分析

      2023-01-05 04:44:50張瑞羅亮王世會郭坤徐偉趙志剛
      水產(chǎn)學(xué)雜志 2022年6期
      關(guān)鍵詞:耐堿碳酸鹽桿菌屬

      張瑞,羅亮,王世會,郭坤,徐偉,趙志剛

      (中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點開放實驗室,黑龍江 哈爾濱 150070)

      以松嫩平原鹽堿地為代表的東北地區(qū)鹽堿地是世界三大著名的碳酸鹽型鹽堿地之一。該地區(qū)的鹽堿水域以高pH(≥8.5)、高堿度(20~30 mmol/L HCO3-)、低鹽度(1‰~3‰ Na+)為特點,難以進行水產(chǎn)養(yǎng)殖。高pH 的水質(zhì)不僅直接影響水產(chǎn)動物健康生長[1],還會導(dǎo)致水體中氨氮的毒性升高,增加對水產(chǎn)動物的危害[2,3]。因此,通過水質(zhì)調(diào)控有效改善鹽堿水質(zhì)環(huán)境,成為開發(fā)與利用鹽堿水域,推動鹽堿水漁業(yè)綠色發(fā)展的主要途徑之一。一直以來,微生物水質(zhì)調(diào)控技術(shù)因其高效、綠色、安全的特點被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[4-6],而“原位”功能性微生物的篩選和應(yīng)用,是實現(xiàn)微生物水質(zhì)調(diào)控的重要途徑[7]。

      長期以來,國內(nèi)外學(xué)者多以高鹽濃度耐受為關(guān)注點,針對海水、鹽湖、鹽堿地等不同鹽堿環(huán)境開展了大量耐(嗜)鹽堿菌的多樣性分析工作[8-14],分離鑒定了大量中度嗜鹽菌、輕度嗜鹽菌等具有重要研究價值的高鹽(堿)耐受菌株[8-14],并在2.5%(w/v)甚至更高的鹽(NaCl)濃度下分析菌株的耐堿能力[9,12]。值得注意的是,微生物要在強堿性條件下生長,就必需調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞內(nèi)pH 范圍以滿足其生命活動的需要。而通過細(xì)胞膜上的Na+/H+、K+/H+等逆向轉(zhuǎn)運蛋白,在Na+等的跨膜運輸?shù)耐瑫r調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH,是耐(嗜)堿菌最主要的抗逆途徑之一[15]。因此環(huán)境中鹽濃度在很大程度上影響著菌株的耐堿能力。

      迄今,尚未有以低鹽度、高pH 為篩選條件,針對碳酸鹽型鹽堿水環(huán)境特點進行的耐(嗜)堿微生物篩選及多樣性分析的報道,也缺少菌株在低鹽濃度下耐堿能力的分析。本研究對大慶連環(huán)湖——典型碳酸鹽型鹽堿地區(qū)池塘水體和底泥中的耐(嗜)堿微生物進行篩選分離、鑒定分類,分析其低鹽度下耐堿能力及pH 調(diào)節(jié)功能,為以“原位”功能微生物為核心的原位水質(zhì)調(diào)控技術(shù)提供微生物資源保障,為碳酸鹽型鹽堿漁業(yè)的綠色發(fā)展提供支撐。

      1 材料和方法

      1.1 培養(yǎng)基及儀器試劑

      富集培養(yǎng)基(3% Sehgal-Gibbons):胰蛋白胨5 g,酵母粉10 g,酸水解酪蛋白5 g,檸檬酸三鈉3 g,KCl2 g,MgSO4·7H2O20 g,NaCl30 g,加水定容至1 000 mL,用NaOH 調(diào)pH 至8.0,滅菌備用。

      篩選培養(yǎng)基(LB):胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,瓊脂15 g,加水定容至1 000 mL,用NaOH調(diào)pH 至8.5,滅菌備用。

      耐堿上限測試培養(yǎng)基:液體LB 培養(yǎng)基,用NaOH 調(diào)至不同pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12),滅菌備用。

      pH 調(diào)節(jié)能力測試培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,酵母粉5 g,蛋白胨5 g,NaCl 50 g,配置固體培養(yǎng)基時額外加入瓊脂15 g,加水定容至1 000 mL,用NaOH 調(diào)pH 至7.0,滅菌備用。

      PCR 儀購自Bio-Rad 公司;凝膠成像分析儀購自Bio-Rad 公司;全溫振蕩培養(yǎng)箱購自滄州萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司(ZQPL-200);生化培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司(SPX-100B-Z);紫外分光光度計購自上海佑科儀器儀表有限公司(752N);便攜式pH 計購自上海沛瑞儀器有限公司(PH400);通用引物由北京華大基因研究院合成;PCR 預(yù)混合溶液購自上海圣生物科技有限公司。

      1.2 樣品采集

      2020 年6 月,從大慶連環(huán)湖地區(qū)的9 口養(yǎng)殖池塘中隨機采集水樣(嫩江水水源)與底泥樣(距離水底0~10 cm)共12 份,分別裝入無菌三角瓶中,帶回實驗室立即進行菌株富集與分離。

      1.3 菌株富集與分離

      將各采集樣品混合均勻,稱取3 g(3 mL)置于200 mL 富集培養(yǎng)基中,30℃150 r·min-1振蕩培養(yǎng)2~3 d 后,將富集的菌懸液在無菌水中逐級稀釋至10-4、10-5、10-6和10-7倍,然后取各稀釋度的菌懸液0.1 mL 分別涂布于pH 8.5 的篩選培養(yǎng)基平板上,在30℃靜置培養(yǎng)。3~5 d 后,挑取單菌落進行多次劃線純化。最后根據(jù)菌落形態(tài)、顏色以及顯微形態(tài)等表型特征鑒定為純培養(yǎng)后,將純培養(yǎng)菌液保藏于-80℃。

      1.4 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

      采用菌液PCR 法擴增純培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA基因序列。擴增引物采用擴增細(xì)菌16S rRNA 的通用引物Eubac27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和Eubac1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’)。PCR 以過夜培養(yǎng)菌液為模板,反應(yīng)體系參照2×Hieff PCR Master Mix 使用說明書配置。反應(yīng)程序:95℃10 min;94℃l min,55℃30 s,72℃1.5 min,30 個循環(huán);72℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送北京華大基因研究院測序,測序引物與擴增引物相同。

      測序所得序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫,獲取序列號(Accession number)。采用Nucleotide Blast 在線分析,找出各序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中同源性最高的已鑒定菌株序列,用MEGA 6.0 中的Clustal X 程序進行多序列比對,然后用Neighbor-Joining 方法選擇Bootstrap 為1 000 個重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進化樹。

      1.5 菌株耐堿上限測試

      所有待試菌株經(jīng)LB(pH 7.0)培養(yǎng)基過夜活化后,分別按1%接種量接種于不同pH 培養(yǎng)基中,在30℃150 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h 后觀察生長情況。

      1.6 菌株pH 調(diào)節(jié)能力驗證

      所有待試菌株經(jīng)活化后,分別按1%接種量接種于200 mL 培養(yǎng)基中驗證pH 調(diào)節(jié)能力,培養(yǎng)液于30℃150 r·min-1震蕩培養(yǎng),每隔4 h 取20 mL 培養(yǎng)菌液測定pH 與OD600吸光度,直至24 h 結(jié)束。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 菌株的篩選與分離

      從本次采集的12 份樣品中共篩選出純培養(yǎng)菌株49 株,經(jīng)16S rRNA 基因序列鑒定,最終共確定菌株24 株。它們分屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、動性球菌屬(Planococcus)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)共9 個菌屬。其中芽孢桿菌屬與微小桿菌屬為優(yōu)勢菌屬,分別為7 株與6 株,占總菌株量的29.17%和25.00%(圖1)。其次是動性球菌屬(Planococcus)3 株,占總菌株量的12.50%;腸球菌屬與腸桿菌屬各2 株,分別占8.33%;氣單胞菌屬、鹽單胞菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬以及假單胞菌屬各1 株,分別占菌株總量的4.17%。

      2.2 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

      用DNAMAN6.0 軟件分別比對分析上述24 株菌的16S rRNA 基因序列及其已鑒定的最近緣種菌株的同源性。結(jié)果表明:CT-WN-B17 與已鑒定的最近緣種菌株同源性為96.35%,CT-MH6-7 與已鑒定的最近緣種菌株同源性為96.84%,而其余同源性均在99.58%~100%之間。碳酸鹽型池塘耐(嗜)堿菌菌群中所有菌株與已鑒定近緣菌株在系統(tǒng)發(fā)育進化樹上也穩(wěn)定聚簇(圖2)。上述結(jié)果支持將除CTWN-B17、CT-MH6-7 以外的22 株菌株認(rèn)定為各自相應(yīng)的已鑒定最近緣種,而菌株CT-WN-B17 和CT-MH6-7 的16S rRNA 序列與已鑒定最近緣種同源性較低,系統(tǒng)進化關(guān)系較遠(yuǎn),具有新種潛質(zhì),需進行進一步鑒定,因而暫將它們分別命名為Lysinibacillus sp.與Enterococcus sp.(表1)。

      圖2 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中耐(嗜)堿細(xì)菌群落的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor -Joining tree of alkalitolerant(alkaliphilic)bacteria in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

      2.3 耐堿上限測定

      以上24 株菌株分屬于細(xì)菌域的2 個門——變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes);9個屬——氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、微小桿菌屬、鹽單胞菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、動性球菌屬以及假單胞菌屬。其中厚壁菌門為優(yōu)勢類群,菌株占比達79.17%;芽孢桿菌屬與微小桿菌屬為優(yōu)勢菌屬,菌株占比分別為29.17%和25.00%。

      以上24 株菌株在1%NaCl 濃度下的耐堿上限在pH 9.0~10.0 之間,其中7 株能耐受pH9.0,芽孢桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬(4/7);10 株能耐受pH9.5,其中芽孢桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬(3/10);7 株能耐受pH10.0,其中微小桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬(4/7)(表1)。上述所有菌株并未表現(xiàn)出對堿性pH 的生長依賴性,均屬于耐堿菌。

      表1 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中的耐(嗜)堿細(xì)菌及其耐堿能力分析Tab.1 Alkalitolerant(alkaliphilic)bacteria and their alkaline-tolerance capacity in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

      2.4 pH 調(diào)節(jié)能力測定

      碳酸鹽型鹽堿池塘耐堿細(xì)菌群落中有兩大優(yōu)勢菌屬,分別為芽孢桿菌屬和微小桿菌屬。后者的功能之一就是可以利用葡萄糖等碳源產(chǎn)酸[16],導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的pH 下調(diào)。為探究鹽堿池塘中優(yōu)勢菌群菌株,即芽孢桿菌屬與微小桿菌屬菌株的pH 調(diào)節(jié)能力,以葡萄糖為補充碳源培養(yǎng)菌株,測定隨菌株繁殖的培養(yǎng)基pH 的變化。

      隨24 h 內(nèi)微小桿菌屬菌株的不斷生長繁殖,菌株CT-WL4-1 將培養(yǎng)基pH 下調(diào)了2.5 個單位(圖3-A);盡管菌株CT-WH4-6 最終的繁殖水平與CT-WL4-1 相差無幾,但僅將培養(yǎng)基pH 下調(diào)了0.6個單位(圖3-B);菌株CT-SL8-1、CT-WH2-6、CT-ML6-1 和CT-ML6-5 繁殖不十分旺盛(OD600≤1.0),24 h 內(nèi)培養(yǎng)基pH 下調(diào)了1.3~1.5 個單位(圖3-C~F)。

      圖3 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘微小桿菌屬細(xì)菌的pH 調(diào)節(jié)能力Fig.3 pH regulation of Exiguobacterium strains in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

      芽孢桿菌屬菌株也具有不同程度調(diào)節(jié)pH 的能力。如圖4 所示,菌株CT-WN-B4、CT-WL5-10 在24 h 內(nèi)繁殖旺盛,分別使培養(yǎng)基pH 下調(diào)了1.1 和1.3 個單位(圖4-A、B);菌株CT-WH4-5、CT-WN-B12 在實驗條件下生長較為微弱,均僅將培養(yǎng)基pH 下調(diào)了不足1 個單位(圖4-C、D);菌株CT-SL8-3、CT-WN-B3 和CT-WN-B8 的繁殖并不十分旺盛(OD600≤1.1),在24 h 內(nèi)將培養(yǎng)基pH 分別下調(diào)了1.8、1.9 和1.2 個單位(圖4-E~G)。上述結(jié)果顯示,在本實驗條件下,已篩選鑒定的6 株微小桿菌屬菌株與7 株芽孢桿菌屬菌株中,微小桿菌屬菌株CT-WL4-1 具有最強的pH 調(diào)節(jié)能力,芽孢桿菌屬菌株CT-SL8-3 和CT-WN-B3 次之。

      圖4 東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中芽孢桿菌屬細(xì)菌的pH 調(diào)節(jié)能力Fig.4 pH regulation of Bacillus strains in carbonate saline-alkali ponds in northeast China

      3 討論

      本研究以高pH、低鹽度為條件從典型碳酸鹽型鹽堿池塘水體和底泥樣品中定向富集、篩選耐(嗜)堿菌,通過16S rRNA 基因同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析進行菌株鑒定分類,獲取耐(嗜)堿菌多樣性信息。結(jié)果表明,東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿池塘中耐堿菌種群豐富,共分離到的49 個菌株,分屬于細(xì)菌域中2 個門(Firmicutes、Proteobacteria)、9 個屬、24 個種。其中多數(shù)菌株屬于厚壁菌門(Firmicutes),兩個優(yōu)勢屬分別為芽孢桿菌屬(7 株,占總菌株的29.17%)和微小桿菌屬(6 株,占總菌株的25%)。絕大多數(shù)菌株的16S rRNA 基因序列與已鑒定的最近緣種序列同源性在99.58%~100%之間。僅腸球菌屬菌株CT-MH6-7 與賴氨酸芽孢桿菌屬菌株CT-WN-B17 的16S rRNA 序列與已鑒定的最近緣種菌株同源性較低,分別為96.35%、96.84%,且系統(tǒng)進化關(guān)系較遠(yuǎn),認(rèn)為其具有新種潛質(zhì)。

      多年來,科研工作者圍繞多個鹽堿環(huán)境開展了耐(嗜)鹽菌的多樣性研究,已在碳酸鹽型鹽堿土壤中篩選鑒定出34 株耐(嗜)鹽菌。這些菌株大多具有5%~10%的耐鹽能力和不同程度的耐堿能力[9]。與之相比,本研究獲得的碳酸鹽型鹽堿池塘耐堿菌多樣性并不十分豐富。比較二者菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其均包含芽孢桿菌屬、微小桿菌屬、鹽單胞菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬和動性球菌屬(Planococcus),這表明上述6 個菌屬的菌株在碳酸鹽型鹽堿土壤中和水體中均有分布。不同的是,土壤中的最優(yōu)勢菌屬葡萄球菌屬(Staphylococcus)并不包含在池塘樣品中,而鹽堿池塘中的優(yōu)勢菌屬微小桿菌屬(Exiguobacterium),在土壤僅分離到1 株。這似乎并不是由菌株篩選條件所致。根據(jù)現(xiàn)有研究背景,微小桿菌屬菌株可以耐受0%~10%濃度的NaCl[16],即采用耐(嗜)鹽菌的篩選條件也可將其分離出,相似的耐(嗜)堿菌的篩選條件也可將葡萄球菌屬菌株分離出來。因此,可以認(rèn)為兩群落結(jié)構(gòu)的差異是由不同菌屬微生物對生存環(huán)境的偏好性選擇導(dǎo)致。微小桿菌屬曾因并未在其他鹽堿環(huán)境中被篩選得到而被認(rèn)為是屬于東北地區(qū)松嫩平原鹽堿土壤的獨特耐鹽菌群類[9],因此建議,微小桿菌屬可作為東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿水體環(huán)境的代表性耐鹽堿菌屬。

      一直以來對于耐堿菌與嗜堿菌的定義并不明確和統(tǒng)一。本研究根據(jù)眾多科研工作者的分類習(xí)慣,將能在高pH 條件下生長,但最適值并不在堿性pH 范圍內(nèi)的歸類為耐堿菌;而最適生長pH 在9.0以上,pH 耐受高達10~12 的則稱之為嗜堿微生物[17]。本研究獲得的所有菌株并未表現(xiàn)出堿性條件的生長依賴性,pH 耐受上限介于9.0~10.0 之間,屬于耐堿菌。本結(jié)果顯然低于一些現(xiàn)有的研究背景[9,18-20],這是因為本實驗條件中更低的鹽濃度影響了菌株的耐堿能力上限。但本研究的結(jié)果更接近菌源環(huán)境的實際條件,更有菌株的原位應(yīng)用指導(dǎo)意義。

      菌群中優(yōu)勢的、且更強耐堿能力的微小桿菌屬菌株,其另一重要功能就是可以利用葡萄糖等碳源產(chǎn)酸[16]。本研究以葡萄糖為補充碳源,以pH 調(diào)節(jié)能力為目標(biāo),在兩大優(yōu)勢菌屬中篩選出3 株具有較強pH 調(diào)節(jié)能力的耐堿菌(包括1 株微小桿菌屬菌株,2 株芽孢桿菌屬菌株),能夠在24 h 內(nèi)將培養(yǎng)基pH下調(diào)1.8~2.5 個單位,具有微生物水質(zhì)調(diào)控應(yīng)用潛力。然而這些菌株是否通過利用葡萄糖合成有機酸來調(diào)節(jié)pH;有些菌株是否也可以利用其他碳源產(chǎn)酸來調(diào)節(jié)pH,這些問題均需進一步驗證與探究。

      本研究填補了我國東北地區(qū)碳酸鹽型鹽堿水土環(huán)境——鹽堿池塘的耐堿菌多樣性的研究空白,在優(yōu)勢菌屬中篩選出了具有較強pH 調(diào)節(jié)能力的耐堿菌株,為碳酸鹽型鹽堿養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控技術(shù)的研發(fā)提供支撐。

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