盛雪晴 趙楠 林亞秋 陳定雙 王瑞龍 李傲 王永 李艷艷

（西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041）

鋅指蛋白這一結構最早由Miller 在非洲爪蟾轉(zhuǎn)錄因子TF ⅢA 中發(fā)現(xiàn)，是含有鋅指結構的蛋白質(zhì)的總稱［1-2］。鋅指蛋白是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，有2%的人類基因參與編碼鋅指蛋白。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)基因表達的核心控制器，調(diào)控著細胞增殖、分化、發(fā)育、代謝、細胞凋亡、自噬和干性維持等多種生物學過程［3］。鋅指蛋白32（zinc finger protein 32，ZNF32）是近年來發(fā)現(xiàn)的屬于Krüppel 相關鋅指家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，人ZNF32包含6 個連續(xù)的典型C2H2 鋅指基序和一個簡并的C2H2 鋅指基序，定位于人10q23-q24染色體區(qū)域［4-6］。已有研究證明，Krüppel 鋅指家族有多個成員可能在細胞分化和增殖中發(fā)揮重要作用［7-9］。

ZNF 家族中ZNF423 被確定為前體脂肪形成的主要決定因子并保持白色脂肪細胞功能。Longo等［10］發(fā)現(xiàn)ZNF423 基因的表觀遺傳修飾調(diào)控小鼠脂肪細胞形成，Matsubara 等［11］發(fā)現(xiàn)ZNF423 基因與雞脂肪細胞分化有關，Chiarella 等［12］發(fā)現(xiàn)ZNF521基因通過抑制ZNF423 的表達負調(diào)控人類脂肪干細胞分化。因此我們猜測ZNF32 可能參與脂肪細胞增殖和分化。

目前關于ZNF32 的研究較少，主要集中于腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面［13-19］，研究指出人ZNF32 與腫瘤細胞干性及耐藥性相關；ZNF32 可通過與干細胞標志物SOX2 啟動子特異性結合調(diào)控斑馬魚側線系統(tǒng)的再生能力；也有研究報道指出ZNF32 參與腫瘤細胞的自噬、凋亡、失巢凋亡等細胞程序性死亡；陳宏麗等［20］發(fā)現(xiàn)ZNF32 的表達水平與STAT3 磷酸化水平呈正比，抑制ZNF32 的表達能干擾STAT3 信號通路從而抑制腫瘤細胞的多種生物學特性?，F(xiàn)階段關于ZNF32 的生物學功能研究較少，而其在山羊前體脂肪細胞中的作用未見報道。

皮下脂肪的累積可影響動物的儲能、代謝、保溫等，而前體脂肪細胞的增殖和分化對脂質(zhì)沉積具有重要作用［21-22］。簡州大耳羊是我國自主培育的第二大山羊品種，本研究旨在以簡州大耳羊為研究對象，利用RT-PCR 克隆山羊的ZNF32 基因序列，通過生物信息學分析工具分析其表達特性，利用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術闡明其在山羊各組織中的表達水平，并探究ZNF32 對山羊皮下前體脂肪細胞增殖和分化的影響。本研究將為山羊乃至肉用經(jīng)濟動物的分子育種等基礎研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物與樣品采集 以成年（1 周歲）健康簡州大耳羊為試驗動物，購自四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司。屠宰后收集羊的腎、肺、心、肝、脾等14 個組織樣品，清洗后置于液氮中保存。本試驗經(jīng)過西南民族大學動物倫理學術委員會審批通過（SMU20160108）。

1.1.2 試驗試劑 自TaKaRa 公司購買TRIzol 試劑、SYBR? Premix ExTaqTM（2×），自成都擎科梓熙生物技術有限公司購買5×pchone007 Versatile Simple Vector Mix，自天根生化科技有限公司購買DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，自康為世紀有限公司購買2×Super Pfx MasterMix，自Thermo 公司購買RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 的合成 從液氮中取出腎、肺、心、肝、脾等14 個組織樣品，使用TRIzol法提取總RNA，檢測OD260/280值及濃度，經(jīng)測定符合實驗標準；將1 μg RNA 作為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山羊ZNF32 基因克隆 以山羊腎臟組織cDNA 為模板，按照GenBank 上牛的ZNF32 基因序列（登錄號：NM_001046119.1）設計PCR 引物（表1）。

PCR 反應體系：高保真DNA 聚合酶12.5 μL，腎組織cDNA 0.5 μL，10 μmol/L 上游引物1.25 μL、10 μmol/L 下游引物1.25 μL，ddH2O 9.5 μL，共計25 μL 反應總體系。PCR 擴增程序：預變性（98℃，3 min）；變性（98℃，10 s），退火（58℃，30 s），延伸（72℃，15 s），35 個循環(huán)；終延伸（72℃，10 min），4℃保溫。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，純化回收連接到007VS 載體上，轉(zhuǎn)化、涂板接種，挑取培養(yǎng)基上陽性菌落進行PCR 鑒定，送至成都擎科生物技術有限公司測序。

1.2.3 山羊ZNF32 基因生物學特性分析 山羊ZNF32 基因生物學特性分析及方法參見表2。

表2 生物信息學分析內(nèi)容及分析工具Table 2 Analytical contents and analysis tools for bioinformatics

1.2.4 山羊ZNF32 基因組織表達差異分析 按照“1.2.1”中的方法，將山羊各組織的總RNA 提取并將其反轉(zhuǎn)錄獲得相應cDNA。使用Primer Primier 5.0對克隆獲得的山羊ZNF32 基因序列設計其特異性qPCR 引物（表1），將TBP基因當做內(nèi)參基因［23］，用qPCR 法對ZNF32 基因在各組織中的表達差異進行檢測。

qPCR 反應體系：SYBR? Premix ExTaqTM（2×）10 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，合計20 μL 反應總體系，每組設置3 個重復。反應條件：預變性（95℃，1 min）；變性（95℃，10 s），退火（60℃，20 s），延伸（72℃，30 s），共39 個循環(huán)。

1.2.5 山羊ZNF32 基因在皮下前體脂肪細胞中的時序表達分析 根據(jù)實驗室前期建立的山羊前體脂肪細胞分離及培養(yǎng)方法對山羊皮下前體脂肪細胞進行原代培養(yǎng)［24］。獲得原代皮下前體脂肪細胞后，進行常規(guī)培養(yǎng)，當細胞傳至F3代且融合度達約80%時，用胰蛋白酶進行細胞消化，用血球計數(shù)板計數(shù)后鋪板，細胞數(shù)為4×104個/孔（12 孔板）。待細胞融合度達約80%時，使用濃度為50 μmol/L 的油酸誘導液進行誘導分化，每2 d 換一次液。分別收集0、24、48、72、96 h 后的細胞。按照“1.2.1”中方法得到各時期細胞的cDNA，以UXT基因作為內(nèi)參基因用于矯正基因的相對表達水平［25］，利用qPCR 法檢測ZNF32 基因在山羊皮下脂肪細胞不同時期的表達差異，qPCR 反應體系及條件同“1.2.4”。

1.2.6 山羊ZNF32 基因CDS 區(qū)序列克隆及過表達載體構建 利用Primer Primier 5.0 對克隆獲得的山羊ZNF32 基因序列設計CDS 區(qū)引物，上游、下游引物分別添加上EcoRI、XhoI 的酶切位點及對應的保護堿基（表1），以“1.2.2”中測序成功后提取的質(zhì)粒為模板克隆ZNF32 基因CDS 序列，構建過表達載體。PCR 反應體系及擴增程序同“1.2.2”。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，純化回收后，酶切PCR 產(chǎn)物和pCMV-Tag2B 載體，16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化、涂板接種，挑取單菌落進行PCR 鑒定，送至成都擎科生物技術有限公司測序。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.2.7 細胞轉(zhuǎn)染、過表達及干擾效率檢測 同“1.2.5”中方法將細胞進行傳代培養(yǎng)，傳至F3代后以7×104個/孔（6 孔板）鋪板，空白試驗組分別以pcDNA3.1 和siRNA（NC）轉(zhuǎn)染，試驗組分別以pcDNA3.1-ZNF32 和siRNA-ZNF32 轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后收取細胞，UXT作為內(nèi)參基因，使用qPCR 法檢測其過表達。轉(zhuǎn)染體系：2 μg pcDNA3.1-ZNF32，400 μL opti，6 μL turbfect。qPCR 反應體系：SYBR?Premix ExTaqTM（2×）6.25 μL，cDNA 0.625 μL，10 μmol/L 上游引物0.625 μL、10 μmol/L 下游引物0.625 μL，ddH2O 4.375 μL，合計12.5 μL 反應總體系，每個樣本設置3 個重復。反應條件同“1.2.4”。

1.2.8 過表達或干擾ZNF32 對增殖抑制相關基因表達量的影響 以“1.2.7”中反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，使用實驗室前期設計并檢測合格的引物（表3），檢測過表達ZNF32 對山羊皮下前體脂肪細胞中增殖抑制相關基因表達的影響，每個樣本設置3 個重復。qPCR 體系及反應條件同“1.2.4”。

表3 增殖抑制相關基因引物信息Table 3 Primers information of genes associated with proliferation inhibition

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析 qPCR 數(shù)據(jù)用“平均值±標準差（Mean±SD）”表示，并用2-ΔΔCt法進行均一化處理；利用SPSS 軟件中的One-way ANOVA 對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗分析。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

2 結果

2.1 山羊ZNF32基因的克隆

為研究山羊ZNF32 的生物學功能，獲得該基因序列，本研究以簡州大耳羊腎組織cDNA 為模板，經(jīng)PCR 擴增后獲得與預期目的產(chǎn)物大小相符的片段（圖1）。測序得到ZNF32 基因片段長度1 049 bp，已提交GenBank 獲得登錄號為MZ054397；經(jīng)序列分析CDS 區(qū)序列長度為822 bp（圖2），與GenBank上山羊ZNF32 基因核苷酸預測序列完全一致，結果表明山羊ZNF32 基因序列克隆成功。

圖1 山羊ZNF32 基因擴增結果Fig.1 Amplification of ZNF32 gene in goat

2.2 山羊ZNF32生物信息學分析

經(jīng)分析顯示，山羊ZNF32 蛋白分子式為C1334H2092N424O394S19，分子量為30 983.03 Da；理論等電點為9.52，帶負電荷（Asp + Glu）和帶正電荷（Arg+ Lys + His）的氨基酸殘基數(shù)分別為21 和60，其不穩(wěn)定系數(shù)為42.47，親水性平均值為-0.813，因此，該蛋白可能為堿性親水不穩(wěn)定蛋白；在氨基酸序列組成中，絲氨酸（Ser）含量為9.2%，占比最高；磷酸化位點預測顯示，山羊ZNF32 蛋白有32 個磷酸化位點（圖2）。功能結構域預測結果顯示，山羊ZNF32 蛋白包含7 個C2H2 鋅指結構（圖2）。

圖2 山羊ZNF32 基因的ORF 序列及推斷的氨基酸序列Fig.2 Sequences of ORF and deduced amino acids of ZNF32 gene in goat

分析該蛋白質(zhì)二級結構可知，149 個氨基酸（54.58%）可能會形成無規(guī)卷曲（c），形成β-轉(zhuǎn)角（t）的氨基酸有28 個（10.26%），48 個氨基酸（17.58%）可能形成α 螺旋（h），48 個氨基酸（17.58%）可能形成延伸鏈（e）（圖4-A）；三級結構經(jīng)預測與二級結構結果一致（圖4-B）；在蛋白相互作用方面，可知ZNF32 蛋白可能與SOX2、ZNF821、MED31、ZNF414、FRA10AC1 等蛋白存在相互作用（圖4-C）。使用NCBI 中Blast 進行比對可知，簡州大耳羊與綿羊、牛的ZNF32 氨基酸序列相似性較高（圖5-A），說明該蛋白在不同的物種間具有較高的保守性。利用MEGA 5.0 軟件根據(jù)山羊與其他物種氨基酸序列同源性構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，山羊ZNF32 與綿羊、牛親緣關系較近，聚于同一分支（圖5-B）。

圖3 山羊ZNF32 蛋白疏水性及氨基酸組成分析Fig.3 Analysis of hydrophobicity and amino acid composition of ZNF32 protein in goat

圖4 山羊ZNF32 蛋白質(zhì)結構及相互作用預測Fig.4 Protein structure and interaction prediction of goat ZNF32

圖5 ZNF32 氨基酸序列比對及蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.5 Amino acid sequence alignment and protein phylogenetic tree of goat ZNF32 gene

2.3 山羊ZNF32基因組織表達分析

以TBP為內(nèi)參基因，采用qPCR 檢測ZNF32 基因在山羊各組織中的表達差異，以背最長肌為對照組織，結果顯示，山羊ZNF32 基因在心、肝、瘤胃、肺等14 個組織中均有表達。其中在大腸中的表達量極顯著高于其他組織（P＜0.01），其次是臂三頭肌、小腸及脾組織，而山羊ZNF32 基因在肝和肺組織中表達量最低（圖6）。以上結果表明山羊ZNF32 基因的表達具有組織特異性。

圖6 山羊ZNF32 組織表達譜Fig.6 Expression profile of ZNF32 gene in different tissues of goat

2.4 山羊ZNF32基因時序表達分析

分別收集誘導0、24、48、72、96 h 后的細胞，以UXT為內(nèi)參基因，采用qPCR 技術檢測ZNF32 基因在山羊皮下前體脂肪細胞不同分化程度的表達差異。結果顯示，隨著誘導時間的延長，與誘導0 h相比，誘導分化24 h、48 h、72 h、96 h 后ZNF32 基因表達水平呈上升趨勢，在96 h 表達量達到最高，差異極顯著（圖7）（P＜0.01）。

圖7 ZNF32 基因在山羊皮下脂肪細胞不同分化階段的相對表達水平Fig.7 Relative expressions of ZNF32 gene in goat during different stages of differentiation

2.5 山羊ZNF32過表達載體構建

為了進一步研究山羊ZNF32 的生物學功能，以“1.2.2”中測序成功后提取的007VS-ZNF32 質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 擴增獲得ZNF32 基因CDS 區(qū)序列（圖8）；以ZNF32 基因CDS 序列構建過表達載體，測序結果顯示，CDS 區(qū)序列與克隆序列完全一致，紅色下劃線處為酶切位點（圖9），以上結果表明pCMVTag2B-ZNF32 過表達載體構建成功。

圖8 山羊ZNF32 基因CDS 區(qū)擴增結果Fig.8 CDS amplification results of goat ZNF32 gene

圖9 山羊ZNF32 基因過表達載體測序結果Fig.9 Sequencing results of goat ZNF32 gene overexpression vector

2.6 山羊ZNF32基因過表達效率及增殖抑制相關基因表達檢測

山羊皮下前體脂肪細胞轉(zhuǎn)染ZNF32 表達質(zhì)粒48 h 后，利用qPCR 檢測ZNF32 過表達效率，結果顯示，與對照組相比，ZNF32 基因表達量上調(diào)了近750 倍（圖10-A）。有研究指出人ZNF32 與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，因此，我們想到山羊ZNF32 是否調(diào)控皮下前體脂肪細胞增殖。本研究利用qPCR 法檢測過表達ZNF32 后對增殖抑制相關基因p21、p27、p53及p57 的表達的影響，結果顯示，過表達ZNF32 后抑制了增殖抑制相關基因p27 及p57 的表達（圖10-B）。

2.7 山羊ZNF32基因干擾效率及增殖抑制相關基因表達檢測

轉(zhuǎn)染ZNF32-siRNA入皮下前體脂肪細胞48 h后，qPCR 檢測結果顯示，與Negative control（NC）組相比，干擾效率為25%左右（圖10-C），干擾ZNF32后促進了增殖抑制相關基因p21、p27、p53 及p57的表達（圖10-D）。

圖10 山羊ZNF32 基因表達效率及增殖抑制相關基因表達檢測Fig.10 Detection of ZNF32 gene expression efficiency and the expressions of genes related to proliferation inhibition in goats

2.8 ZNF32調(diào)控山羊皮下脂肪細胞增殖作用的機制探索

為了進一步明析ZNF32 對山羊皮下前體脂肪細胞增殖的調(diào)控機制，鑒于其轉(zhuǎn)錄因子的身份，人ZNF32 的轉(zhuǎn)錄結合序列為GA（C/T）ATTT［12］，上述研究結果表明過表達ZNF32 后增殖抑制相關基因p27 及 p57 基因表達明顯下調(diào)，干擾ZNF32 后增殖抑制相關基因p21、p27、p53 及 p57 明顯上調(diào)。經(jīng)過對人p21、p27、p53 及p57 基因啟動子區(qū)（-2 000-+100）分析發(fā)現(xiàn)，p21、p27 及 p53 基因啟動子區(qū)存在ZNF32 轉(zhuǎn)錄結合序列（圖11）。以上結果表明ZNF32 可能通過靶向p21、p27 及 p53 的表達來調(diào)控山羊皮下脂肪細胞增殖。

圖11 p53、p21 和p27 啟動子區(qū)ZNF32 結合序列Fig.11 Binding sequence of ZNF32 in p53，p21 and p27 promoter region

3 討論

Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子是一類DNA 結合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這個家族內(nèi)的每一個調(diào)控因子的羧基端都有Cys2/His2 鋅指結構域，這個結構域十分保守。ZNF32 基因作為Krüppel 樣鋅指家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，對于DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的作用。研究表明ZNF32 參與調(diào)控人腫瘤細胞增殖和分化等多種行為［13-18］。

為了研究山羊ZNF32 的表達特性，本研究成功克隆了山羊ZNF32 基因序列，得到CDS 區(qū)822 bp，共編碼273 個氨基酸。通過生物信息學分析工具對山羊ZNF32 序列進行分析，結果顯示，ZNF32 蛋白理論等電點為9.52，親水性平均值為-0.813，因此，該蛋白可能為堿性親水蛋白。山羊ZNF32 蛋白有32個磷酸化位點，磷酸化作為蛋白翻譯后修飾的方式之一，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡等功能［26］，因此這些磷酸化位點可能有助于ZNF32 蛋白發(fā)生磷酸化。功能結構域預測結果顯示，山羊ZNF32 蛋白包含7 個C2H2 鋅指結構，其中6 個連續(xù)的典型C2H2 鋅指序列和1 個簡并的C2H2 鋅指序列，與Han［4］的報道一致，且研究表明，C2H2 型鋅指蛋白參與細胞的增殖、分化和發(fā)育等過程［27-28］，因此ZNF32 可能參與皮下前體脂肪細胞增殖與分化。利用STRING 預測蛋白相互作用，結果顯示，ZNF32蛋白可能與SOX2 等蛋白存在相互作用，Wei 等［15］發(fā)現(xiàn)，ZNF32 與干細胞標志物SOX2 啟動子特異性結合后，可負調(diào)控SOX2 的表達，與預測結果一致。通過構建山羊ZNF32 組織表達譜，知悉其在山羊各組織中均有表達，在大腸中表達量最高。

為進一步研究ZNF32 在山羊脂肪細胞中的功能，本研究構建了山羊ZNF32 時序表達譜，知悉ZNF32 基因表達水平在誘導分化過程中呈上升趨勢，在96 h 表達量達到最高，極顯著高于分化前。據(jù)報道，在目前KLF 家族中發(fā)現(xiàn)的18 個成員（即KLF1-KLF18）中有6 個成員（KLF2、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7 和KLF15）在分化的細胞中的表達水平顯著或極顯著高于前體脂肪細胞，KLF4、KLF9、KLF12 可能在山羊前體脂肪細胞中具有重要調(diào)控作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)，與ZNF32 同屬ZNF 家族的ZNF423 控制小鼠脂肪細胞形成并與雞脂肪細胞分化有關，ZNF521 是人類脂肪干細胞分化的負調(diào)控因子［10-12］。因此，ZNF32 基因在山羊脂肪細胞分化過程中可能具有調(diào)控作用，后續(xù)實驗將進一步闡明ZNF32 在山羊脂肪細胞中的作用機制。

利用qPCR 技術檢測增殖抑制相關基因的相對表達水平，結果顯示，過表達ZNF32 后顯著抑制了p27 及p57 基因的表達，干擾ZNF32 后顯著促進了p21、p27、p53 及p57 基因的表達。P21、p27 及p57 是近年來發(fā)現(xiàn)的激酶抑制蛋白CIP/KIP 基因家族，參與細胞周期及新陳代謝的調(diào)節(jié)，發(fā)揮對細胞周期的負性調(diào)控作用［30-32］，p53 是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，p53 蛋白轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因p21 和MDM2的表達，從而抑制CDK 活性，對細胞周期進行負性調(diào)控［33］。Sun 等［34］報道，過表達KLF15 可部分通過調(diào)控p21 和p57 抑制胃癌細胞的增殖；Wang 等［35］報道，HOXA5 通過調(diào)控p27 抑制宮頸癌細胞增殖；Yang 等［36］報道，BOP1 通過調(diào)節(jié)p53 的表達調(diào)控胃癌細胞增殖；孫等［37］報道，MIR221 可通過與p57 mRNA 3′-UTR 區(qū)域結合使結腸癌細胞中p57 蛋白表達下降而促進結腸癌細胞增殖，本研究經(jīng)過對人p21、p27、p53 及p57 基因啟動子區(qū)（-2 000-+100）分析發(fā)現(xiàn)，p21、p27 及p53 基因啟動子區(qū)均存在ZNF32 轉(zhuǎn)錄結合序列，因此推測ZNF32 可能通過靶向調(diào)控p21、p27 或p53 基因表達調(diào)控山羊皮下脂肪細胞增殖。

4 結論

本研究成功克隆獲得山羊ZNF32 基因序列（登錄號：MZ054397），全長1 049 bp，CDS 區(qū)822 bp，共編碼273 個氨基酸。組織表達譜顯示，ZNF32 在山羊各組織中均有表達，在大腸中表達量最高。時序表達譜顯示，隨著誘導分化時間的延長，ZNF32的表達量升高，ZNF32 基因可能促進皮下脂肪細胞的分化。過表達ZNF32 后抑制增殖抑制相關基因p27 及p57 的表達，干擾ZNF32 后促進了增殖抑制基因p21、p27、p53 及p57 基因的表達，ZNF32 可能通過靶向p53、p21 及p27 基因?qū)崿F(xiàn)對皮下脂肪細胞增殖的調(diào)控。