程琳琳，安 鋒，謝貴水，王紀(jì)坤，彭文濤，周立軍

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所, ?？?571101；2. 海南儋州熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測(cè)研究站, 海南 儋州 571737)

【研究意義】巴西橡膠樹[Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.]，以下簡(jiǎn)稱橡膠樹,原產(chǎn)地的生長環(huán)境造就了其對(duì)高氣溫的要求。雖然，我國在橡膠樹北緣栽培中取得了卓越的成就，但是由于冬春季受寒潮及冷空氣的影響，寒害仍是橡膠樹栽培與發(fā)展的限制性因子[1]。橡膠樹在不同類型的寒害情況下，主要表現(xiàn)為枝葉干枯、莖干黑斑、樹體各部位爆皮流膠等受害癥狀[2]。因寒害導(dǎo)致的莖干爆皮流膠不僅會(huì)導(dǎo)致樹皮潰爛壞死，還會(huì)引起后期小蠹蟲、病原菌的入侵，造成寒害后的次生病蟲害，致使橡膠樹的抗逆性下降，并可加重因寒害造成的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。因此，探索不同橡膠樹品種耐寒性及低溫所致爆皮流膠的差異對(duì)于橡膠樹抗寒栽培管理措施的實(shí)施以及爆皮流膠機(jī)制研究至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，以生理指標(biāo)反映橡膠樹耐寒能力的應(yīng)用較為廣泛。李玲等[5]低溫脅迫2個(gè)橡膠樹品種芽接苗，測(cè)定其電導(dǎo)率并進(jìn)行恢復(fù)，根據(jù)2個(gè)品種低溫下表現(xiàn)及不同組織電導(dǎo)率的變化情況，確定了較為抗寒的品種?？讖V紅等[6]以低溫脅迫下，葉片活性氧相關(guān)成分含量、抗氧化相關(guān)物質(zhì)含量及酶類活性高低來反映橡膠樹耐寒與非耐寒品種間的差異。結(jié)合隸屬函數(shù)法及主成分分析法分析低溫下橡膠樹不同品種(系)的生理指標(biāo)差異，不僅可以比較不同品種(系)自然低溫下的抗寒能力[7-9]，而且可以判斷人工模擬不同類型寒害條件下，不同橡膠樹品種的耐寒性強(qiáng)弱[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于自然及人工模擬低溫條件下，橡膠樹幼苗極少發(fā)生爆皮流膠寒害癥狀[11]，所以將低溫下生理生化指標(biāo)與爆皮流膠情況的差異相結(jié)合來研究橡膠樹不同品種寒害與爆皮流膠的耐受性鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選擇熱研7-33-97、熱研7-20-59、湛試327-13、93-114等4個(gè)橡膠樹品種一年生芽接苗為材料，結(jié)合設(shè)置的人工模擬低溫條件，測(cè)定低溫下其葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)和部分生理生化指標(biāo)的變化差異，通過隸屬函數(shù)法、主成分分析法對(duì)其耐寒性進(jìn)行比較，并結(jié)合低溫條件所致爆皮流膠的情況分析，以期探索橡膠樹爆皮流膠耐受性的機(jī)制，為完善橡膠樹抗寒評(píng)價(jià)體系和抗寒栽培技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為國家熱帶植物種質(zhì)資源庫—橡膠樹(National Tropical Plants Germplasm Resource Center-Rubber Tree)提供的一年生芽接苗(2020年5月芽接，高度為0.8～1.0 m)，品種為熱研7-33-97、熱研7-20-59、湛試327-13及93-114。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇長勢(shì)基本一致的4個(gè)橡膠樹芽接苗(每個(gè)品種20株)品種，放置于人工氣候室內(nèi)進(jìn)行低溫脅迫處理。在低溫脅迫的第0、2、4、6天測(cè)定各品種各植株相同部位葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)和生理生化指標(biāo)，0 d作為對(duì)照。低溫脅迫6 d后，在人工氣候室內(nèi)恢復(fù)1周，將所有植株移入自然環(huán)境中。從植株開始出現(xiàn)流膠癥狀時(shí)至移入自然環(huán)境條件前，記錄每個(gè)品種流膠情況。在移入自然環(huán)境55 d后，統(tǒng)計(jì)其存活情況。低溫脅迫期間人工氣候室的控制條件為：12 h光照，12 h黑暗，相對(duì)濕度為80%；光照強(qiáng)度為75～100 μmol/(m2·s)；光照時(shí)段溫度控制在(16±1)℃，黑暗時(shí)段溫度控制在(4±1)℃?；謴?fù)期間控制條件為：除溫度控制在(26±1)℃之外，其他同于低溫脅迫時(shí)情況。

1.2.2 測(cè)定方法 采用WALZ PAM-2500便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。各時(shí)間梯度生理指標(biāo)測(cè)定時(shí)各品種各植株至少選擇2個(gè)葉片，各品種各時(shí)間梯度至少選取3個(gè)植株的葉片，各品種各時(shí)間梯度的葉片混合后設(shè)置3個(gè)重復(fù)。參照李小琴等[8]的方法，采用METTLER TLEDO-FE38電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率。葉綠素含量采用混合液法[12]測(cè)定。采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒測(cè)定橡膠樹植株葉片可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、SOD活性。采用廣陸數(shù)顯游標(biāo)卡尺(111N-101-10G)測(cè)定橡膠樹芽接苗流膠情況(點(diǎn)狀流膠測(cè)流膠點(diǎn)的直徑，條狀流膠測(cè)流膠的長度和寬度)后計(jì)算其面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

葉綠素?zé)晒鈪?shù)及生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，采用Excel和DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法，用OriginPro 2018進(jìn)行繪圖；用隸屬函數(shù)法[13]對(duì)4個(gè)橡膠樹品種芽接苗進(jìn)行耐寒性比較，用IBM SPSS軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下不同品種葉片生理生化指標(biāo)的變化

2.1.1 相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量 由圖1-A可知，低溫脅迫的過程中，4個(gè)橡膠樹品種與各自對(duì)照相比，相對(duì)電導(dǎo)率均增加，各品種相對(duì)電導(dǎo)率呈先升高后下降趨勢(shì)。但是，有別于熱研7-20-59、湛試327-13和93-114 3個(gè)品種相對(duì)電導(dǎo)率逐步升高而后下降趨勢(shì)，熱研7-33-97相對(duì)電導(dǎo)率表現(xiàn)為陡然升高后逐步降低，它在第2天的相對(duì)電導(dǎo)率比其對(duì)照升高69.31%，均高于熱研7-20-59、湛試327-13和93-114 3個(gè)品種的27.80%、17.84%和40.10%；而后在第4～6天，熱研7-33-97相對(duì)電導(dǎo)率與其對(duì)照相比，變化幅度均小于其他3個(gè)品種。在低溫過程中，熱研7-33-97相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于熱研7-20-59。

數(shù)值為3個(gè)數(shù)值的平均值，誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)差，小寫字母表示相同時(shí)間梯度下品種間存在顯著差異(P<0.05)

2.1.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量 如圖1-C所示，在受低溫的過程中，除熱研7-33-97可溶性糖含量為“升—降—升”趨勢(shì)外，另外3個(gè)品種的可溶性糖含量均為先降后升趨勢(shì)。脅迫4～6 d的過程中，4個(gè)品種可溶性糖含量均低于其對(duì)照。低溫下，湛試327-13可溶性糖含量最高，而且變化幅度也是最小，與其對(duì)照相比，其降低幅度僅為0.08%、8.78%和5.43%，均低于其他3個(gè)品種。在脅迫的4～6 d，4個(gè)品種間可溶性糖含量的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，湛試327-13和93-114的可溶性糖含量均高于熱研7-33-97和熱研7-20-59。

由圖1-D可以看出，受低溫的影響，4個(gè)品種可溶性蛋白含量變化的趨勢(shì)不一致：熱研7-33-97和93-114呈“降—升—降”趨勢(shì)，在低溫的第4天，熱研7-33-97和93-114的可溶性蛋白含量增幅均較大，熱研7-33-97可溶性蛋白含量與其對(duì)照相比，增幅為20.12%，93-114與其對(duì)照相比，增加12.43%；熱研7-20-59呈先降后升趨勢(shì)，與其對(duì)照相比，可溶性蛋白含量均降低；湛試327-13呈先升后降趨勢(shì)，在低溫的第2天，可溶性蛋白含量增加，后期又呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)。

2.1.3 超氧化物歧化酶活性 如圖1-E所示，低溫條件下，4個(gè)品種的超氧化物歧化酶活性的變化趨勢(shì)保持一致，均為先升高后下降的趨勢(shì)。低溫條件的第2天，與各自對(duì)照相比，熱研7-33-97、熱研7-20-59、湛試327-13、93-114超氧化物歧化酶活性增幅最大，分別為其對(duì)照的2.11倍、3.10倍、26.09%、1.75倍。低溫條件的第6天，雖然93-114超氧化物歧化酶活性有所下降，但是與其對(duì)照相比，其變化幅度仍然增加，而其他3個(gè)品種與各自對(duì)照相比變化幅度均降低。同時(shí)，除了低溫脅迫的第4天，其他時(shí)間梯度，4個(gè)品種超氧化物歧化酶活性的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.1.4 葉綠素含量 由圖1-F、1-G、1-H可見，低溫脅迫下，熱研7-33-97葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量為先升高后下降的趨勢(shì)，低溫的第4天，其值最高。熱研7-20-59葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量一直呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，可能是低溫逆境下葉片失水所致，但是其含量均顯著低于其他3個(gè)品種。湛試327-13 葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量均呈“降—升—降”趨勢(shì),低溫的第4天，其葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量最高。93-114葉綠素a、葉綠素總量呈先升后降趨勢(shì)，而葉綠素b含量呈“升—降—升”趨勢(shì)，低溫脅迫的第2、6天，其葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量最高。與其對(duì)照相比，93-114葉綠素a含量、葉綠素總量增加幅度均高于其他3個(gè)品種，分別為60.13%、28.53%、27.50%和56.50%、25.50%、25.26%。

2.1.5 PSII最大光化學(xué)效率 由圖1-I可得知，隨著低溫時(shí)間的延長，4個(gè)品種的PSII最大光化學(xué)效率呈逐步下降的趨勢(shì)，熱研7-33-97、湛試327-13和93-114的PSII最大光化學(xué)效率均高于熱研7-20-59，其差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。與各自對(duì)照相比，熱研7-33-97的 PSII最大光化學(xué)效率降低幅度分別為0.28%、2.42%、6.17%，均小于熱研7-20-59的5.08%、6.96%、9.09%；93-114 的 PSII最大光化學(xué)效率降低幅度分別為1.06%、1.61%、2.60%，均小于湛試327-13的2.33%、5.78%、5.87%。

2.2 隸屬函數(shù)法比較橡膠樹品種耐寒性差異

采用隸屬函數(shù)法對(duì)4個(gè)橡膠樹品種低溫脅迫下各項(xiàng)生理生化指標(biāo)分別進(jìn)行計(jì)算，比較其耐寒性。由表1可以看出，4個(gè)品種的平均隸屬度從大到小的排序?yàn)椋?93-114>湛試327-13>熱研7-33-97>熱研7-20-59，但是93-114 和 湛試327-13的差值并不大。

表1 不同品種生理生化指標(biāo)隸屬函數(shù)值及平均隸屬度

2.3 主成分分析法比較橡膠樹品種耐寒性差異

對(duì)4個(gè)橡膠樹品種生理生化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，其結(jié)果見表2。由主成分分析結(jié)果可以看出：前3個(gè)主成分的特征值分別為5.330、2.086和1.584，貢獻(xiàn)率分別為59.226%、23.173%和17.600%，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為100%，可以反映低溫脅迫下橡膠樹生理生化指標(biāo)的全部信息。由表3可以看出：第1主成分中，具有較高荷載的為葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量及最大光化學(xué)效率；第2主成分中，具有較高荷載的為可溶性糖含量、SOD活性和相對(duì)電導(dǎo)率；第3主成分中，具有較高荷載的為可溶性蛋白含量。

表2 主成分特征值及累計(jì)貢獻(xiàn)率

表3 主成分荷載矩陣

根據(jù)主成分分析結(jié)果，可得出3個(gè)主成分函數(shù)表達(dá)式。

果然周副書記很老到，他說，我?guī)愕綆讉€(gè)部門走走。幾天來，周書記馬不停蹄地帶到我找電力、稅務(wù)、銀行、火車站等部門單位化緣，又找到鎮(zhèn)上很有些實(shí)力企業(yè)老板拉了些贊助，五萬元的經(jīng)費(fèi)基本上沒問題。

Y1=0.264X1+0.078X2-0.217X3+0.428X4+0.429X5+0.429X6+0.392X7+0.370X8+0.189X9

Y2=-0.456X1+0.158X2+0.600X3+0.096X4+0.090X5+0.094X6+0.289X7-0.240X8+ 0.491X9

Y3=-0.352X1+0.760X2-0.007X3-0.050X4+0.021X5-0.030X6+0.068X7+0.031X8-0.439X9

由3個(gè)主成分函數(shù)表達(dá)式，分別計(jì)算出4個(gè)品種耐寒性的綜合得分值：Y=0.592Y1+0.232Y2+0.176Y3。由表4可知，低溫脅迫下，不同橡膠樹品種主成分綜合得分排序?yàn)椋?3-114 >湛試327-13>熱研7-33-97>熱研7-20-59。

表4 不同橡膠樹品種主成分得分及排序情況

2.4 不同橡膠樹品種爆皮流膠差異性比較

在低溫脅迫的第4天，橡膠樹芽接苗植株開始出現(xiàn)爆皮流膠癥狀。流膠產(chǎn)生于植株綠色莖干的葉痕、芽眼、節(jié)間等位置，或者出現(xiàn)在總?cè)~柄、總?cè)~柄的葉枕、腋芽處。與此同時(shí)，熱研7-33-97和湛試327-13植株莖干流膠伴隨出現(xiàn)黑斑；熱研7-33-97和93-114葉片出現(xiàn)黑斑。由表5可以看出，低溫脅迫下，熱研7-20-59流膠植株數(shù)最多，熱研7-33-97最少。橡膠樹各品種總流膠個(gè)數(shù)與植株存活率情況與隸屬函數(shù)法及主成分分析法得出的品種耐寒性保持一致；而流膠面積大小，即流膠量的大小與耐寒性并不一致，這可能與品種膠乳含量、干膠含量、總固形物含量等因素有關(guān)。

表5 不同橡膠樹品種流膠差異情況比較

3 討 論

在不利的溫度環(huán)境下，植物受影響最大的細(xì)胞器就是葉綠體，異常的環(huán)境溫度導(dǎo)致光合電子傳遞性能的降低及影響PSII，使得多余能量產(chǎn)生一系列活性氧，光合作用和葉綠素合成均因活性氧受到抑制。活性氧不僅影響氧化還原信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且它的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害[14]。作為評(píng)價(jià)光合能力的重要指標(biāo)，葉綠素在收集、傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、吸收光能中具有重要作用[15]，葉綠素減少會(huì)降低植物光保護(hù)的性能[16]。 另一方面，葉綠素的合成涉及一系列的酶促反應(yīng)，過程較為復(fù)雜。環(huán)境溫度一旦下降，由于碳固定減慢，導(dǎo)致葉綠體中的“激發(fā)壓力”增加，庫容量就會(huì)減少[17]，葉綠素合成中相關(guān)催化酶活性也受影響，所以葉綠素合成與功能發(fā)揮受抑制程度存在差異，以致本研究中不同橡膠樹品種之間葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量變化也存在著差異。PSII最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)常被用作植物逆境條件下抗性高低的重要指標(biāo)[18]。當(dāng)光能超過植物光合作用所需時(shí)，光合效率就會(huì)大幅下降，出現(xiàn)光抑制，尤其是在逆境下，植物的光抑制最為明顯[19]。本研究中，低溫脅迫下，熱研7-20-59的最大光化學(xué)效率均小于其他3個(gè)品種，也就意味著其對(duì)低溫最為敏感，4個(gè)橡膠樹品種的PSII受低溫的影響，其開放程度明顯降低，光合性能受到影響[20]。一旦植物受不利溫度的脅迫，葉綠體受損傷，導(dǎo)致光合電子傳遞性能降低及PSII受抑制，光能轉(zhuǎn)化為熱能，植物借助熱耗散消耗多余熱量，拮抗過剩能量對(duì)其本身的損傷，多余的能量就以活性氧的形式散發(fā)出來，致使細(xì)胞脂膜過氧化產(chǎn)生丙二醛，丙二醛的積累反過來加劇植物受損傷的程度[21]。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，與各自對(duì)照相比，4個(gè)橡膠樹品種葉片丙二醛(MDA)含量最終均達(dá)到顯著水平，也就意味著低溫對(duì)各品種植株細(xì)胞膜均造成了損傷[22]，細(xì)胞膜的透性就逐步增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲隨之增加，即相對(duì)電導(dǎo)率上升[23]。在低溫下，4個(gè)橡膠樹品種植株葉片相對(duì)電導(dǎo)率與各自對(duì)照相比，其電導(dǎo)率均呈增加的趨勢(shì)，但后期由于活性氧清除系統(tǒng)所涉及的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及相關(guān)酶的作用，植物拮抗低溫逆境的防御功能逐步顯現(xiàn)。作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，可溶性糖可維持細(xì)胞液的流動(dòng)性與細(xì)胞功能的正常性，降低植物在低溫下的傷害[24]。在低溫環(huán)境下，湛試327-13植株葉片可溶性糖含量是最高的，而且變化幅度也是最小的。而且湛試327-13和93-114植株葉片可溶性糖含量均高于其他2個(gè)品種，所以其耐寒性與其可溶性糖含量較高是密不可分的。作為親水性膠質(zhì)，可溶性蛋白可降低細(xì)胞冰點(diǎn)[25]，參與低溫逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞修復(fù)調(diào)控等[26]，會(huì)隨著植物低溫馴化而升高[27]。本研究中，與各自對(duì)照相比，除了熱研7-20-59以外，其他3個(gè)橡膠樹品種葉片可溶性蛋白(SP)在低溫下均出現(xiàn)了增幅的峰值，所以可溶性蛋白積累在降低熱研7-33-97、湛試327-13和93-114 3個(gè)品種的滲透勢(shì)，提高它們的耐寒性方面起到了較好的作用。逆境下，SOD可清除植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，維持細(xì)胞完整性[28]，從而提高植物的抗逆性[29]。低溫逆境中，SOD活性被激活，植物的耐寒性提高，植物產(chǎn)生了對(duì)低溫的自我保護(hù)能力，但是隨著低溫過程的延長，植物受低溫影響程度加大，SOD活性而逐步下降[30]，這與本研究中4個(gè)橡膠樹品種SOD活性的變化趨勢(shì)是一致的。

橡膠樹的根、莖、葉(葉片、小葉柄、大葉柄)中均存在產(chǎn)生膠乳的乳管，但在莖干中最多[31]。由此，本研究中4個(gè)橡膠樹品種在植株的莖干、葉部位均發(fā)生了爆皮流膠癥狀。不同品種乳管個(gè)數(shù)存在差異，膠乳濃度(干膠含量、總固形物含量)[32-33]和因植株?duì)I養(yǎng)情況而致的凝固酶的差異，導(dǎo)致其流膠性能的差異[31]。另一方面，受低溫脅迫的影響，可能由于細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等各組成成分在細(xì)胞壁中的分布、結(jié)合方式以及各組成成分本身的性能改變?cè)斐芍参锛?xì)胞壁及宏觀力學(xué)性能的改變[34]，以致于不同橡膠樹品種低溫下乳管破裂的方式以及破裂程度不同，最終導(dǎo)致4個(gè)橡膠樹品種流膠株數(shù)、流膠面積與其耐寒性并不完全一致。

以單一生理生化指標(biāo)判斷植物的耐寒性較為困難，因?yàn)橥晃锓N的不同品種之間的同一生理生化指標(biāo)變化規(guī)律并不完全相同，以單一生理生化指標(biāo)來判斷品種間的耐寒性勢(shì)必造成評(píng)判的片面性及結(jié)果的差異、不客觀性[35]。與此同時(shí)，由于橡膠樹耐寒性是較為復(fù)雜的數(shù)量性狀，而且對(duì)不同類型的低溫寒害的表現(xiàn)在品種間的差異較大[36]。因此，結(jié)合隸屬函數(shù)法、主成分分析法對(duì)本研究中的4個(gè)橡膠樹品種耐寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可以避免單一生理生化指標(biāo)評(píng)判的局限性和各指標(biāo)信息的重疊性，使結(jié)果更加客觀、全面[37]。

4 結(jié) 論

本研究通過隸屬函數(shù)法、主成分分析法對(duì)低溫脅迫下4個(gè)橡膠樹品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、葉綠素含量及最大光化學(xué)效率等指標(biāo)進(jìn)行其耐寒性的綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，隸屬函數(shù)分析法與主成分分析法評(píng)價(jià)的耐寒性順序?yàn)椋?3-114 >湛試327-13> 熱研7-33-97>熱研7-20-59。因低溫導(dǎo)致的4個(gè)品種流膠株數(shù)的排序是：熱研7-33-97<湛試327-13 = 93-114<熱研7-20-59。從以上結(jié)果可以看出，93-114和湛試327-13是較好的耐寒性橡膠樹品種，適合于寒害較為嚴(yán)重的地區(qū)種植，熱研7-33-97是膠乳含量較高、耐寒性中等的橡膠樹品種，適合于寒害不太嚴(yán)重地區(qū)種植[38]。橡膠樹不同品種因低溫所致的爆皮流膠的耐受性機(jī)制及爆皮流膠耐受性與耐寒性的關(guān)系有待進(jìn)一步探索。