扎沖十三味丸HPLC指紋圖譜研究

王會品，王金梅，劉丹娜

1鄭州市第三人民醫(yī)院，鄭州 450000；2河南大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 475000

扎沖十三味丸由訶子、制草烏、木香、石菖蒲、珊瑚（制）、人工麝香、丁香、珍珠（制）、沉香、肉豆蔻、磁石（煅）、禹糧土、甘草共13味藥材制得，具有祛風(fēng)通竅、舒筋活血、鎮(zhèn)靜安神功效，多用于半身不遂、口眼歪斜、腰腿不利、四肢麻木、筋骨疼痛、言語不清、神經(jīng)麻痹、風(fēng)濕及關(guān)節(jié)疼痛等[1]。方中訶子被譽(yù)為“藏藥之王”，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用，內(nèi)含活性成份沒食子酸、槲皮素和鞣花酸等[2-4]。石菖蒲的藥理活性成份為揮發(fā)油α細(xì)辛醚、β細(xì)辛醚和細(xì)辛醛等成份，多用于神昏癲癇、健忘失眠、耳鳴耳聾、脘痞不饑和噤口下痢[5-6]。甘草在成方制劑中應(yīng)用廣泛，素有“十方九草”之稱，其含有的三萜類成份中以甘草酸含量最高，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗肝損傷等生物活性，甘草含有的黃酮類成份主要有甘草素、甘草苷等，具有抑菌、抗炎、抗病毒及抗氧化等作用[7-9]。木香中含有豐富的萜類成份，主要有抗炎、抗腫瘤和抗?jié)兊淖饔?，代表性成份有木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[10-11]。扎沖十三味丸收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》蒙藥分冊[1]中，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下未對其內(nèi)在活性提出定量質(zhì)控要求，相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]也只是對其含有的個別成份進(jìn)行考察，未見有關(guān)指紋圖譜方面報道。

中藥指紋圖譜能客觀合理、科學(xué)全面地評價中藥質(zhì)量，在中藥質(zhì)量分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[15-16]。本研究收集了2個不同廠家、共14批次的扎沖十三味丸樣品，建立HPLC指紋圖譜，并對指紋圖譜進(jìn)行聚類分析及主成份分析，考察不同產(chǎn)地扎沖十三味丸的內(nèi)部質(zhì)量，為系統(tǒng)客觀、科學(xué)評價扎沖十三味丸質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國Waters公司）；AL204型分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo公司）；SDPP制樣粉碎機(jī)（湖南三德科技股份有限公司）；KQ-600DB型超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

α細(xì)辛醚對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號X-037-150921，含量≥99.0%）；木香烴內(nèi)酯對照品（批號：111524-201911，含量99.9%）、鞣花酸對照品（批號111959-201602，含量89.3%）、沒食子酸對照品（批號110831-201906，含量91.5%）、去氫木香內(nèi)酯對照品（批號111525-201912，含量99.5%）、槲皮素對照品（批號100081-201610，含量99.1%）、甘草苷對照品（批號111610-201607，含量93.1%）、甘草酸銨對照品（批號110731-202021，含量96.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（美國天地公司，色譜純）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用14批扎沖十三味丸的規(guī)格均為2g/10粒。其中，S1～S8由阜新蒙藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號分別為：20170901、20170902、20180302、20180405、20180502、20180507、20180601、20180905；S9～S14由內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為：170203、170512、170605、180401、180502、181005。

2 方法與結(jié)果[13]

2.1 色譜條件

Waters Tnature C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～5min，5%乙腈；5～18min，5%→12%乙腈；18～25min，12%→28%乙腈；25～35min，28%→40%乙腈；35～40min，40%乙腈；40～55min，40%→58%乙腈；55～75min，58%乙腈；75～80min，58%→5%乙腈）；檢測波長為254nm；流速為1.0ml/min；柱溫為36℃；進(jìn)樣量為10μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備

取本研究指認(rèn)共有峰所需對照品各適量，用甲醇溶解后配制成每1ml含沒食子酸0.125mg、鞣花酸0.321mg、甘草苷0.209mg、槲皮素0.225mg、甘草酸銨0.189mg、木香烴內(nèi)酯0.211mg、去氫木香內(nèi)酯0.165mg、α細(xì)辛醚0.351mg的混合對照品儲備溶液。精密量取混合對照品儲備液5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取扎沖十三味丸，粉碎，過80目篩。取細(xì)粉約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，閉塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率60kHz）1h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取扎沖十三味丸供試品溶液（批號170203），按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄共有峰色譜圖，以槲皮素為參比峰，計算其他24個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.2%～0.9%，各共有峰相對峰面積的RSD為0.5%～1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批扎沖十三味丸供試品溶液（批號170203），在室溫放置0、3、6、9、12、18、24h后，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測定，記錄各共有峰色譜圖，以槲皮素為參比峰，計算其他24個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.5%～1.2%，各共有峰相對峰面積的RSD為1.0%～2.0%，表明扎沖十三味丸供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批扎沖十三味丸供試品（批號170203）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測定，記錄各共有峰色譜圖，以槲皮素為參比峰，計算其他24個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.4%～1.1%，各共有峰相對峰面積的RSD為0.7%～1.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 扎沖十三味丸HPLC指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 指紋圖譜的建立

取14批扎沖十三味丸樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測定，記錄各批樣品色譜圖。將14批扎沖十三味丸供試品色譜圖在同條件下積分處理后，導(dǎo)出AIA格式數(shù)據(jù)至“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件中，設(shè)定扎沖十三味丸S1號樣品色譜圖為參考圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.2min，采用多點(diǎn)校正法對14批樣品色譜圖進(jìn)行自動匹配分析，得到扎沖十三味丸對照指紋圖譜（見圖1）和14批扎沖十三味丸HPLC指紋圖譜疊加圖譜（見圖2），共確定24個共有峰。

圖1 扎沖十三味丸對照指紋圖譜

圖2 14批扎沖十三味丸樣品HPLC疊加圖譜（S1～S14）

2.4.2 相似度評價分析

設(shè)定S1號供試品色譜圖為參考圖譜，對14批扎沖十三味丸指紋圖譜進(jìn)行整體相似度評價。結(jié)果，14批扎沖十三味丸供試品指紋圖譜相似度為0.960～0.993，說明不同生產(chǎn)廠家扎沖十三味丸指紋圖譜較為相似。相似度評價數(shù)據(jù)見表1。

表1 14批扎沖十三味丸樣品相似度評價數(shù)據(jù)

2.4.3 共有峰指認(rèn)及相對峰面積計算

通過與混合對照品HPLC色譜圖（見圖3）比對，24個共有峰中共指認(rèn)出8個成份，即峰5為沒食子酸、峰10為鞣花酸、峰13為甘草苷、峰15為槲皮素、峰20為甘草酸銨、峰21為木香烴內(nèi)酯、峰22為去氫木香內(nèi)酯、峰24為α細(xì)辛醚。其中，以峰15（槲皮素）的峰面積較大，位置適中，故設(shè)定為參照峰，計算其余23個色譜峰相對峰面積，見表2。

圖3 混合對照品HPLC色譜圖

表2 14批扎沖十三味丸樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積

續(xù)表

2.5 聚類分析

為考察14批扎沖十三味丸樣品間差異，本研究采用SPSS 22.0軟件，以14批扎沖十三味丸指紋圖譜峰面積為變量，采用平均歐式距離法對樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。由圖可知，14批扎沖十三味丸大致分為2類，Ⅰ類包括S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，Ⅱ類包括 S9、S10、S11、S12、S13、S14。結(jié)合樣品信息可知，Ⅰ類均為阜新蒙藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，Ⅱ類為內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)?？梢?，不同廠家扎沖十三味丸之間相關(guān)性和相似度結(jié)果較為一致。

圖4 14批扎沖十三味丸樣品聚類分析樹狀圖

2.6 主成份分析

以扎沖十三味丸指紋圖譜中24個共有峰面積為變量，利用SPSS 22.0軟件，共提取特征值大于1的主成份3個，累計方差貢獻(xiàn)率為90.162%。其中，3個主成份特征值分別為19.072、1.482、1.084，其方差貢獻(xiàn)率分別為79.467%、6.176%、4.519%，且前3個主成份累計方差貢獻(xiàn)率為90.162%，提示模型預(yù)測性良好，見表3。初始因子載荷矩陣結(jié)果顯示（見表4），主成份1主要體現(xiàn)峰1、峰3、峰4、沒食子酸、峰6、峰7、峰9、鞣花酸、峰11、甘草苷、峰14、槲皮素、峰16、峰17、峰19、甘草酸銨及α細(xì)辛醚的信息。

表3 3個主成份的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表4 初始因子載荷矩陣

續(xù)表

用SIMCA 14.1分析軟件對14批樣品共有峰面積進(jìn)行主成份分析，主成份得分圖見圖4。結(jié)果表明，14批扎沖十三味丸樣品被分為2類，與“2.5”項(xiàng)下聚類分析結(jié)果一致。

圖4 14批樣品主成份分析得分圖

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

結(jié)合文獻(xiàn)[13-14]，在進(jìn)行色譜條件優(yōu)化過程中，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相時，指紋圖譜峰質(zhì)量較好，各目標(biāo)成份均能有效分離，且信號強(qiáng)度較好。波長選取時，在190～400nm波段分別對沒食子酸、鞣花酸、甘草苷、槲皮素、甘草酸銨、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和α細(xì)辛醚對照溶液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在254nm處各成份均有較強(qiáng)吸收，且次波長處指紋圖譜中色譜峰個數(shù)較多，所以本研究采用254nm為監(jiān)測波長。

3.2 提取條件的優(yōu)化

扎沖十三味丸由13味藥材制得，含有多種成份，因不同組份存在極性差異，所以樣品有效成份的提取步驟對實(shí)驗(yàn)開展十分重要。為探索供試品制備方法，本實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)法，選擇甲醇濃度、溶劑用量、超聲提取時間為3個因素，以指紋圖譜的峰面積之和為指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果以每2g成藥粉末加50%甲醇，超聲提取1h效果最佳。

3.3 指紋圖譜分析

本研究從14批樣品的指紋圖譜中共提取到24個共有峰，通過與混合對照品色譜圖比對，指認(rèn)了其中8個成份。為進(jìn)一步考察扎沖十三味丸的組內(nèi)和組間質(zhì)量，對14批樣品進(jìn)一步進(jìn)行聚類分析和主成份分析，結(jié)果14批樣品聚為2類，說明不同廠家扎沖十三味丸可能因處方、工藝等因素不同而導(dǎo)致指紋圖譜存在差異，但同一廠家均勻性較好。在進(jìn)行主成份分析時，從24個共有峰中共提取到3個主成份，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.162%，提示其能充分反映指紋圖譜絕大部分信息，且指認(rèn)的8個成份在3個主成份中均有較大貢獻(xiàn)率，說明8個成份代表性較佳，可作為藥品的質(zhì)控指標(biāo)，用于客觀合理評價扎沖十三味丸的質(zhì)量。

4 小結(jié)

中藥及其制劑均為多組份復(fù)雜體系，因此評價其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的、能提供豐富鑒別信息的檢測方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測定等方法都不足以解決這一問題。建立中藥指紋圖譜能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成份的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價，這也正好符合中醫(yī)藥理論下的整體學(xué)說。扎沖十三味丸由13味藥材制成，簡單的多成份分析方式代表性欠佳，而指紋圖譜可客觀、系統(tǒng)地對扎沖十三味丸進(jìn)行質(zhì)量評價，有利于科學(xué)監(jiān)管藥品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)首次建立了扎沖十三味丸HPLC指紋圖譜法，方法簡單、實(shí)用，方法學(xué)考察專屬性強(qiáng)，可有效評價扎沖十三味丸質(zhì)量，為進(jìn)一步完善扎沖十三味丸的標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。