高 榮，馬 麗，王 川，常海霞，王 濱，李云峰，，冉玉華，郭文治

（1.山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，山西太原 030001；2.解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心麻醉科，北京 100070；軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 3.毒物藥物研究所，4.軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

七氟醚（sevoflurane）是臨床常用全身麻醉藥物之一，因其誘導(dǎo)迅速、術(shù)中血液動力學(xué)平穩(wěn)、蘇醒較快的特點(diǎn)被廣泛用于成人和小兒麻醉[1]。然而，2016年美國FDA對3歲以下兒童和孕婦手術(shù)麻醉提出了警告：發(fā)育早期多次接觸七氟醚可能導(dǎo)致大腦發(fā)育異常[2]，并造成遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙[3]。近年越來越多研究表明，孕酮（progesterone，Prog）可改善神經(jīng)損傷癥狀并提高認(rèn)知學(xué)習(xí)能力，這一效果在多種神經(jīng)損傷模型上均得到了證實(shí)[4-7]。但Prog對孕期七氟醚吸入導(dǎo)致的子代神經(jīng)損傷是否有保護(hù)效應(yīng)未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探索Prog預(yù)給藥對孕中期大鼠七氟醚吸入致幼齡子代大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

15只SD孕大鼠，SPF級，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)溫度23～26℃，濕度50%～70%，12 h光暗循環(huán)（8∶00～20∶00燈光照明），自由攝食飲水。本研究動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：2022-55。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

七氟醚（凱特利），上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；Prog，美國Sigma-Aldrich公司；2-羥丙基-β-環(huán)糊精，北京百靈克生物科技有限公司；FITC Annexin Ⅴ/7-AAD凋亡試劑檢測盒，美國Tonbobio公司；胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；兔抗大鼠突觸后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD95）、突觸蛋白1、橋尾蛋白、離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、β肌動蛋白和GAPDH單抗，美國Abcam公司；兔抗大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF）和酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor，TKR）單抗，武漢博士德公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗體，美國CST公司；小動物麻醉機(jī)，北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；麻醉監(jiān)護(hù)儀，美國GE公司；臺式冷凍離心機(jī)，日本KUBOTA公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司；樣品冷凍研磨儀，北京赫德科技有限公司；冰凍切片機(jī)，美國Thermo公司；正置顯微鏡和數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)，日本NIKON公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和七氟醚吸入損傷模型制備

孕鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組和模型+Prog（2，4和8 mg·kg-1）組。模型組在孕11～16 d每日8∶00 am im給予溶劑（25%環(huán)糊精溶液），孕14～16 d給予溶劑1 h后吸入七氟醚（濃度2.5%，流量 2 L·min-1，2 h·d-1）制備七氟醚暴露模型[8]；模型+Prog（2，4和8 mg·kg-1）組在孕11～16 d im給予不同劑量Prog，孕14～16 d于同等條件下吸入七氟醚；正常對照組在孕11～16 d im給予溶劑，孕14～16 d于同等條件下吸入壓縮空氣。

所有孕鼠在七氟醚吸入過程中均進(jìn)行氧飽和度和心率檢測，以觀察大鼠生命體征，處理結(jié)束后放回動物房正常飼養(yǎng)至子代出生。取1周齡子代大鼠（子鼠）海馬組織進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測子鼠海馬細(xì)胞凋亡率

取子鼠海馬組織置冰冷PBS緩沖液中，以0.125%胰蛋白酶37℃消化1 h至組織呈絮狀懸液，懸液經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，所得細(xì)胞懸液經(jīng)300×g離心5 min，棄上清，加1 mL預(yù)冷PBS液，同等條件下重復(fù)離心2次棄上清，在所得細(xì)胞沉淀中加入250 μL 1×結(jié)合緩沖液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×109L-1。取100 μL細(xì)胞懸液于流式管中，按照FITC Annexin Ⅴ/7-AAD凋亡試劑檢測盒說明書，加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL 7-AAD溶液，混勻避光孵育30 min后使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo_V10軟件分析海馬細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western印跡法檢測子鼠海馬組織突觸相關(guān)蛋白表達(dá)

依照文獻(xiàn)[18]方法，取子鼠海馬組織加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，加入研磨珠4℃研磨1 min，靜置離心后取上清，BCA定量測定蛋白濃度，而后與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮10 min后備用。配置分離膠和濃縮膠后上樣，上樣量為50 μg，80 V恒定電壓電泳90 min，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜100 min，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST清洗3次后分別加入抗PSD95、突觸蛋白1、橋尾蛋白、GDNF或TKR的一抗（均為1∶1000），4℃搖床過夜。TBST清洗3次后孵育熒光二抗（1∶5000），TBST清洗3次。以GAPDH或β肌動蛋白作為內(nèi)參對照，使用Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白IA值的比值反映目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光檢測子鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞激活水平

取子鼠全腦浸泡在4%多聚甲醛中，4℃固定24 h，換30%蔗糖溶液脫水24 h，冰凍切片機(jī)切片，厚度為20 μm。使用PBS漂洗5 min，封閉液室溫封閉3 h，棄封閉液，加入抗Iba-1或GFAP抗體，4℃過夜，回收一抗后用PBS漂洗，加熒光二抗，室溫避光孵育2 h，棄二抗，用PBS漂洗，用DAPI封片后使用正置顯微系統(tǒng)觀察拍照。每張切片選取海馬組織相同區(qū)域的3個(gè)不同視野，用Image J軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以Iba-1陽性染色細(xì)胞數(shù)量反映小膠質(zhì)細(xì)胞的激活水平，GFAP陽性染色細(xì)胞數(shù)量反映星形膠質(zhì)細(xì)胞激活水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Prog對子鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（圖1）顯示，與正常對照組比較，模型組海馬細(xì)胞早期凋亡率（P＜0.01）、晚期凋亡率（P＜0.05）和總凋亡率（P＜0.01）均顯著升高；與模型組比較，模型+Prog各劑量組子鼠海馬晚期凋亡率和總凋亡率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+Prog 4和8 mg·kg-1組早期凋亡率也顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示Prog對七氟醚引起的子鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平升高具有逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。

Fig.1 Effect of progesterone（Prog）on apoptosis rate of one-week-old offspring rat（offspring rat）hippocampus cells by flow cytometry.The pregnant rats were divided into five groups.The model group and model+Prog groups were im given solvent or Prog（2，4 and 8 mg·kg-1） during the 11th-16thdays of pregnancy，and were inhaled given sevoflurane（concentration 2.5%，flow rate 2 L·min-1，2 h·d-1）1 h after drug treatment during the 14th-16thdays of pregnancy.The normal control group was im given solvent during the 11th-16thdays of pregnancy，and inhaled compressed air under the same conditions.The hippocampus of offspring rats was taken for detection.B，C and D were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 Prog對子鼠海馬GDNF和TKR蛋白表達(dá)水平的影響

檢測結(jié)果（圖2）顯示，與正常對照組比較，模型組GDNF（P＜0.05）和TKR（P＜0.01）蛋白表達(dá)水平顯著降低；與模型組比較，模型+Prog 4和8 mg·kg-1組GDNF和TKR表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of Prog on levels of glial cellline-derived neurotrophic factor（GDNF）and tyrosine kinase receptor（TKR）expression in hippocampus of offspring rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 Prog對子鼠海馬PSD95、突觸蛋白1和橋尾蛋白表達(dá)水平的影響

突觸相關(guān)蛋白檢測結(jié)果（圖3）顯示，與正常對照組比較，模型組子鼠海馬PSD95、突觸蛋白1和橋尾蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，模型+Prog 8 mg·kg-1組PSD95表達(dá)水平升高（P＜0.05），模型+Prog 2和4 mg·kg-1組PSD95表達(dá)水平無顯著變化；模型+Prog各劑量組突觸蛋白1和橋尾蛋白表達(dá)水平均無顯著變化。

Fig.3 Effect of Prog on levels of synapse-related protein expressions in hippocampus of offspring rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.PSD95：postsynaptic density-95.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.4 Prog對子鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活水平的影響

海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活水平檢測結(jié)果（圖4）顯示，與正常對照組比較，模型組CA1區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，模型+Prog 4和8 mg·kg-1組Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。提示Prog可改善七氟醚誘導(dǎo)的子鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活。

Fig.4 Effect of Prog on number of ionized calcium binding adapter molecule 1（lba-1）positive cells in hippocampus CA1 region of offspring rats by immunofluorescence staining.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.5 Prog對子鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活水平的影響

海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活水平檢測結(jié)果（圖5）顯示，與正常對照組比較，模型組CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05）；與模型組比較，模型+Prog 4和8 mg·kg-1組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05，P＜0.01）。提示Prog可改善七氟醚誘導(dǎo)的子鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活。

Fig.5 Effect of Prog on number of glial fibrillary acidic protein（GFAP）positive cells in hippocampus CA1 region of offspring rats by immunofluorescence staining.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

孕中期是臨床進(jìn)行妊娠期非產(chǎn)科手術(shù)最常見的一個(gè)時(shí)期[9]，是人類胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的第1個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，對外界刺激極其敏感[10]。本研究參照文獻(xiàn)[11-13]選取孕中期SD大鼠進(jìn)行七氟醚干預(yù)造模，參照文獻(xiàn)[14-16]的造模濃度和方式，研究Prog對七氟醚吸入導(dǎo)致子代神經(jīng)發(fā)育障礙的影響。

研究結(jié)果顯示，大鼠孕中期七氟醚吸入引起子鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率上升，突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降，提示子鼠可能存在神經(jīng)元損傷和突觸發(fā)育異常。該結(jié)果與文獻(xiàn)[17-19]結(jié)果一致。Prog預(yù)給藥逆轉(zhuǎn)了七氟醚吸入引起的上述改變，表明Prog對七氟醚引起子代神經(jīng)損傷具有預(yù)防效應(yīng)，該結(jié)果與文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道一致。

既往研究表明，Prog在4～16 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)均可改善突觸可塑性，減輕神經(jīng)損傷[23-24]。本課題組前期采用SD大鼠孕14～16 d吸入七氟醚制備七氟醚損傷模型[18]，并在孕11～16 d給予不同劑量的 Prog（1，2，4，8和 16 mg·kg-1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Prog 2 mg·kg-1即可逆轉(zhuǎn)七氟醚引起的子代大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平升高。因此，本研究選取Prog 2，4和8 mg·kg-1研究Prog預(yù)處理對七氟醚引起的子代神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，Prog預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)大鼠孕中期七氟醚吸入所致子代海馬Iba-1和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活可能是Prog神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。小膠質(zhì)細(xì)胞可被七氟醚激活，并進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α等促炎因子釋放，從而造成神經(jīng)元損傷[25]，據(jù)此推測，Prog對七氟醚導(dǎo)致子代神經(jīng)損傷效應(yīng)的預(yù)防作用可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞激活可介導(dǎo)多種營養(yǎng)因子釋放。TKR是GDNF通路下游的一個(gè)跨膜酪氨酸激酶受體，是GDNF分子信號傳入細(xì)胞內(nèi)的樞紐。正常情況下GDNF可通過TKR激活胞內(nèi)下游信號通路，進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，TKR可在疾病或藥物等外界環(huán)境刺激下發(fā)生突變，表現(xiàn)為過度激活或失活[26]。本研究結(jié)果表明，Prog 4和8 mg·kg-1能顯著逆轉(zhuǎn)七氟醚吸入引起的子鼠海馬GDNF和TKR表達(dá)下調(diào)，表明Prog的作用機(jī)制與激活GDNF/TKR相關(guān)通路有關(guān)。Prog對GDNF/TKR通路的精確調(diào)節(jié)機(jī)制有待深入研究。

激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可通過維持或重塑突觸可塑性，進(jìn)而改變突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)水平[27-28]。本研究檢測了突觸相關(guān)蛋白水平，以探討Prog的神經(jīng)保護(hù)作用是否在突觸水平起效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠孕中期七氟醚吸入可引起子代海馬PSD95、突觸蛋白1和橋尾蛋白3種突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降，表明其具有突觸損傷作用，與文獻(xiàn)[29]報(bào)道一致；而Prog可改善孕中期七氟醚吸入引起的子代海馬PSD95水平下降。PSD95可調(diào)節(jié)興奮性突觸，是N-甲基-D-天冬氨酸受體的支架蛋白。在星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)元之間突觸形成的過程中，PSD95可能參與促進(jìn)突觸的形成[30]。推測Prog激活星形膠質(zhì)細(xì)胞與促進(jìn)PSD95水平升高可能具有協(xié)同效應(yīng)，可進(jìn)一步促進(jìn)突觸形成，改善七氟醚引起的突觸損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，Prog預(yù)處理可減輕大鼠孕中期七氟醚吸入對子代造成的神經(jīng)損傷，該效應(yīng)可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、促進(jìn)GDNF/TKR表達(dá)、發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用、抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸相關(guān)蛋白水平下降有關(guān)。