人載脂蛋白A1的表達、純化與羊多抗血清制備

楊欣，趙邑，潘薇薇，梁欣欣，張全愛

（山西省生物研究院有限公司，山西太原 030006）

載脂蛋白A1（ApoA1）是ApoA族最多的一種組分，ApoA1為單一多肽鏈，由243個氨基酸殘基組成，分子量為26 kDa，無糖基化和二硫鍵，是高密度脂蛋白（HDL）的主要結構蛋白，占HDL蛋白質(zhì)的65%～70%，而其他脂蛋白中載脂蛋白A1極少，故載脂蛋白A1是HDL的特征性載脂蛋白。血清載脂蛋白A1水平反映HDL的水平，國內(nèi)外許多研究結果表明，載脂蛋白A1極易同體內(nèi)的脂類物質(zhì)親和，并將之運送至肝臟進行分解代謝，從而避免因血漿中的脂類物質(zhì)過多造成沉積，發(fā)生一系列的心血管系統(tǒng)疾病。人血清中載脂蛋白A1的含量十分豐富[1]，其濃度為1.0～1.2 mg/mL[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，載脂蛋白A1是細胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的特殊重要因素，能與磷脂、多種血漿因子及細胞膜受體結合，參與血漿蛋白的分泌及細胞受體識別脂蛋白的標志，從而調(diào)節(jié)HDL代謝。此外，還可激活軟磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，促進細胞內(nèi)膽固醇的運出、酯化和轉(zhuǎn)移[5]。

近年來，高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein，HDL）及其主要結構蛋白載脂蛋白Al以其保護動脈粥樣硬化的作用而聞名[6-7]。動脈粥樣硬化性心血管疾病的增多，使人們?nèi)找骊P注載脂蛋白A等相關危險因子在臨床中的檢測。目前，已有大量臨床研究明確指出載脂蛋白A1等是當前臨床實驗室脂類檢測項目中預測動脈粥樣硬化性心血管疾病最優(yōu)價值的指標[8]。載脂蛋白A1已被用來監(jiān)測藥物或飲食治療心血管疾病的療效，并有助于某些異常脂蛋白血癥的特異性診斷，因此載脂蛋白A1是生物檢測的重要原料。

目前載脂蛋白A1的制備主要依賴天然提取，天然提取的原料為人血漿，采用密度梯度離心法制備存在生產(chǎn)量少[9-11]、對設備的要求高、原料獲取困難以及不適合企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)等問題，為了改變這一現(xiàn)狀，研究者們采用離子交換柱法、疏水層析法、大柱電泳法、金屬離子法、層析聚焦法來提取人血漿中ApoA-1，但均存在蛋白純度低的問題[12-17]?；诖?，本文研究了載脂蛋白A1的蛋白結構，載脂蛋白A1無二硫鍵、糖基化修飾，可用于原核表達，利用重組表達的蛋白對山羊進行免疫制備抗血清。

1 材料與方法

1.1 菌株

感受態(tài)DH5α、BL21（DE3），天根生化科技（北京）有限公司；原核表達載體pET-28a來自本實驗室。

1.2 試劑

Taq PCR預混液（1 mL），上海生工生物工程股份有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI（2 000 units）、XhoI（2 500 units），NEB（北京）有限公司；T4連接酶（24 000 U），天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉（500Grams），英國OXOID公司；胰蛋白胨（500Grams），英國OXOID公司；硫酸卡那霉素（5G），上海生工生物工程股份有限公司；IPTG，純度≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司；咪唑，純度≥99.5%，生工生物工程（上海）股份有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris），規(guī)格500 g，生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉，純度≥99.5% 生工生物工程（上海）股份有限公司；碳酸鈉，純度≥99.5%；碳酸氫鈉，純度≥99.5%；DEAE基質(zhì)（500 mL）美國GE Healthcare公 司；Ni Sepharose High performance（1 mL），美國GE Healthcare公司；弗氏佐劑：弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（10 mL），德國Sigma公司；牛血清白蛋白（5 g），生工生物工程（上海）股份有限公司；TMB雙組分顯色液（500 mL），北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（100 mL），生工生物工程（上海）股份有限公司；考馬斯亮藍蛋白快速染色液（500 mL），北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型），規(guī)格P0010S，上海碧云天生物技術有限公司；HRP標記兔抗山羊IgG（100 μL），生工生物工程（上海）股份有限公司；ELISA 終止液（100 mL），生工生物工程（上海）股份有限公司；載脂蛋白A（ApoA1）測定試劑盒（免疫比濁法），北京安圖生物工程有限公司。

1.3 儀器與設備

C1000 Touch Thermo Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司；HERAEUS Pico 21離心機，美國Thermo公司；Mini-PROTEAN? Tetra垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司；DYY-BC電泳儀，北京六一生物科技有限公司；UVD-680-3雙束紫外檢測儀，上海金達生化儀器有限公司；7600-010全自動生化分析儀，日立（中國）有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物合成與擴增

參照GenBank報告的人ApoA1序列（GenBank：A11693.1）及其限制性核酸內(nèi)切酶位點分析結果，設計PCR引物用于擴增載脂蛋白A1，長度為732 bp，編碼244個氨基酸，上游引物5’-GCTACATATG(NdeI)GATGAACCACCACAGAGC-3’，下游引物5’-GAGTCT CGAG(XhoI)CTGAGTGTTCAACTTC-3’，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4.2 表達載體的構建

PCR擴增產(chǎn)物0.8%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，雙酶切（NdeI、XHOI）雙酶切后按目的片段與載體片段3∶1比例將目的基因片段與線性化的表達載體pET-28a混合，用T4連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，接種于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）-LB平板，于37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落在LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，第2天轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 300 r/min振蕩培養(yǎng)4～6 h增菌，用菌落PCR鑒定菌液，陽性菌液用細菌質(zhì)粒提取試劑盒（天根）提取質(zhì)粒后送至（生工）測序。

1.4.3 重組蛋白的誘導和表達

將測序正確的載脂蛋白A1-pET-28a轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，接種至卡那霉素-LB平板于37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落接種于卡那霉素-LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6，然后加入1.0 mmol/L IPTG，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，8 000×g離心，超聲破碎。采用離子交換層析（DEAE填料）（平衡液：20 mmol/L Tris pH 8.0； 洗 脫 液：20 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH 8.0）與Ni-NTA（平衡液：20 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH 8.0； 洗 脫 液：20 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0）親和層析柱純化表達的載脂蛋白A1。

1.4.4 蛋白濃度及活性檢測

1.4.4.1 BCA法測定蛋白濃度

使用BCA蛋白濃度測定試劑盒，將標準品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL 和 20 μL加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL，相當于標準品濃度分別為0.000 mg/mL、0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.100 mg/mL、0.200 mg/mL、0.300 mg/mL、0.400 mg/mL 和0.500 mg/mL；加適當?shù)臉悠返?6孔板的樣品孔；各孔加入200 μL BCA工作液，于37 ℃放置20～30 min；用酶標儀測定A562；根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

1.4.4.2 免疫比濁法測定載脂蛋白A1活性

使用載脂蛋白A1測定試劑盒（免疫比濁法）檢測，用去離子水稀釋校準品，以水位為零點，建立工作曲線；將樣品與質(zhì)控品同時在生化儀上進行檢測，并計算出載脂蛋白A1的濃度。

1.4.5 載脂蛋白A1的免疫

選取山西省高平市山羊4只（編號為144、145、170、190），共計免疫6次。佐劑：弗氏佐劑，第1次免疫為完全佐劑，間隔21 d，第2次以后用不完全佐劑，每次間隔時間為14 d，免疫劑量為2.5 mg。3免后定期采集山羊的免疫血清。

1.4.6 雙向瓊脂擴散試驗鑒定多克隆抗體

在平皿上配制1.2%的瓊脂平板，厚度控制在3 mm左右，用滴管頭部以梅花型排列方式打一組小孔，通過酒精燈火焰微微加熱封底，并對各孔標號。中央孔加入羊抗人ApoA1的陽性抗血清10 μL，1～5孔分別加入不同稀釋倍數(shù)的待檢測蛋白溶液（1∶4、1∶8、1∶16、1∶32），6孔加生理鹽水作為陰性對照。37 ℃孵育24～36 h，取出后觀察結果，有白色沉淀線的為陽性反應。

1.4.7 間接酶聯(lián)免疫吸附測定法（Elisa）測定多克隆抗體效價

將0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）作為包被液包被純化的載脂蛋白A1，包被量每孔為100 ng，設免疫前血清作為陰性對照，4 ℃過夜，37 ℃條件下用1% BSA封閉2 h。將山羊抗血清進行倍比稀釋作為一抗，一抗于37 ℃孵育1 h；HRP標記兔抗山羊IgG為二抗，二抗于37 ℃孵育1 h。TMB為顯色底物，用ELISA 終止液終止反應后用酶標儀測定各孔OD450值并分析結果。

計算陽性血清與陰性血清的吸光度之比，當陽性血清/陰性血清＜1.5時為陰性，當陽性血清/陰性血清≥2.1為陽性，將陽性血清/陰性血清≥2.1時所對應的抗體最高稀釋倍數(shù)作為多克隆抗體的效價。

2 結果與分析

2.1 載脂蛋白A1 PCR片段擴增結果

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見在750 bp左右處有擴增產(chǎn)物，見圖1。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切后，與線性化載體pET-28a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，使用pET-28a通用引物（T7 5-TAATACGACTCA TATAGGG-3；T7t 5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3）進行菌液PCR擴增，pET-28a質(zhì)粒作為對照擴增片段大小為280 bp左右，見圖2（a）。如圖2（b）所示，載脂蛋白A1-pET-28a擴增片段為1 100 bp左右，泳道4、泳道5為陽性質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒進行測序，測序結果與GeneBank報告的人載脂蛋白A1序列完全相同。

圖1 載脂蛋白A1PCR擴增產(chǎn)物

圖2 菌落PCR結果

2.2 載脂蛋白A1的表達和純化結果

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21-DE3中，用1 mmol/L IPTG誘導過夜，誘導表達后，菌液8 000×g離心20 min，超聲破碎后，SDS-PAGE結果顯示，載脂蛋白A1能高效表達，并以可溶形式表達（見圖3），蛋白大小為26 kDa，與預期一致。經(jīng)離子交換層析與Ni-NTA親和層析后顯示為單一的蛋白條帶（見圖4）。

圖3 載脂蛋白A1重組表達結果

圖4 載脂蛋白AI的純化

2.3 蛋白濃度檢測及活性檢測

用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定載脂蛋白A1濃度，純化后的蛋白稀釋8倍，A562讀數(shù)為0.674 3，根據(jù)圖5標準曲線可得，蛋白總濃度為4.8 mg/mL。稀釋4倍后，蛋白總濃度為1.2 mg/mL；經(jīng)載脂蛋白A1測定試劑盒（免疫比濁法）測定該蛋白中載脂蛋白A1的含量為1.15 mg/mL，純度達到95.5%。

圖5 BCA法測定蛋白濃度標準曲線

2.4 雙向瓊脂擴散試驗

采集免疫后的羊血清，選擇不同濃度稀釋后進行瓊脂擴散試驗，如圖6所示，出現(xiàn)特異條帶判定為陽性，出現(xiàn)條帶的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價。制備的羊抗人ApoA1抗血清對ApoA1抗原呈陽性反應，效價為1∶16。

圖6 雙向瓊脂擴散實驗結果

2.5 山羊免疫及效價測定

第3次免疫后采血進行Elisa檢測，4只羊（山羊編號為144、145、170、190）的抗血清最高效價為1∶512 000，最低效價為1∶256 000（見圖7），個體存在差異，但均達到免疫效價要求。

圖7 羊抗血清效價測定結果

3 討論

大量臨床研究表明，載脂蛋白A1是預測冠心病最有價值的指標之一，同時也是其他脂類代謝紊亂疾病等的輔助觀察項目[18]。載脂蛋白A1檢測試劑盒廣泛用于臨床冠心病的診斷，因此羊抗人載脂蛋白A1抗血清是該檢測試劑的關鍵核心原料。目前，該檢測試劑大部分依賴進口，主要原因是載脂蛋白A1的制備、純化工藝、免疫動物以及免疫方法等不成熟。

本文采用基因重組方法，原核表達載脂蛋白A1，表達量大且表達產(chǎn)物以可溶形式存在，在一定程度上減少了包涵體變復性的煩瑣工作。Ni-NTA親和層析法純化后蛋白純度較低，為解決這一問題，本文采用兩步法純化載脂蛋白A1，先經(jīng)離子交換層析去除部分雜蛋白，再經(jīng)Ni-NTA親和層析獲得較高純度的蛋白。經(jīng)載脂蛋白A1活性檢測試劑盒檢測，該蛋白的活性較高，可作為天然載脂蛋白A1的替代品用于山羊的免疫。該方法的建立可應用于工業(yè)化生產(chǎn)。

在載脂蛋白A1抗山羊血清的制備中，本實驗著重在山羊選取、抗原乳化、免疫程序、免疫途徑等幾個方面進行了優(yōu)化。本次實驗選取的山羊位于山西省晉城市高平縣內(nèi)，該地域晝夜溫差大，森林覆蓋率高，優(yōu)質(zhì)的牧草資源為山羊的養(yǎng)殖提供了得天獨厚的自然條件，也為蛋白免疫提供了基礎，優(yōu)化抗原免疫量，皮下多點注射是一種誘導抗體產(chǎn)生的較佳的免疫途徑，通過該方法獲得了很好的免疫效果。本文分別免疫4只山羊，效價均能達到1∶100 000以上。個體之間也存在差異，其中最高效價達到1∶512 000，最低效價1∶256 000。所制備的抗血清為載脂蛋白A1的檢測分析和相關研究提供了重要的工具，可為我國醫(yī)藥企業(yè)自主生產(chǎn)羊抗人載脂蛋白A1抗血清提供技術支撐，有助于減少進口依賴，提升我國該領域的研究水平。

4 結論

本文成功制備了重組載脂蛋白A1，并將該蛋白用于山羊免疫，得到了效價較高的抗血清，方法簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。今后還需繼續(xù)提高載脂蛋白A1純化的效率，優(yōu)化蛋白免疫方案，提升山羊的免疫效價。