金銀花提取物綠原酸對鏈球菌感染的小鼠模型凝血和炎癥相關指標的影響

洪靈杰，劉完美，應瀚霆，彭可昕，陳程，時歡，姚雨涵，段文彧

（長沙醫(yī)學院，湖南長沙 410219）

溶血性鏈球菌由Billrth于1877年發(fā)現(xiàn)，是與人類感染密切相關的病原菌。因溶血性鏈球菌感染造成的臨床疾病種類繁多，不同感染部位、感染特征的患者，其治療措施均有一定差別。目前，抗生素濫用形勢依然嚴峻，從食材或中藥材角度挖掘或研發(fā)新型藥物至關重要[1]。綠原酸（Chlorogenic Acid，CGA）是酚酸化合物中抗菌效果最為顯著的酸類物質，廣泛存在于綠咖啡和茶中[2]。金銀花（又稱忍冬）很早就被用于治療各種熱性病，如身熱、熱毒瘡癰、咽喉腫痛以及發(fā)疹等，但是關于其藥效發(fā)揮的機制研究直到現(xiàn)代才被發(fā)現(xiàn)和深入研究[3-4]。已有研究證實，金銀花中富含CGA，高純度CGA能有效治療流感病毒、病毒性心肌炎、呼吸道感染和皰疹病毒。此外，CGA還是一種常見的生物活性膳食多酚，其主要功效為抗氧化、抗炎癥、解熱以及保護神經，而最新研究顯示其還具有一定的抗菌功效[5]。本文對80只健康成年小鼠進行了對照實驗研究，旨在探究金銀花提取物綠原酸干預鏈球菌感染模型小鼠對血清炎癥指標表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由長沙醫(yī)學院動物實驗中心提供（清潔級）健康成年小鼠80只，雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，體重在160～180 g。實驗室模擬光照和黑暗場景各12 h交替進行飼養(yǎng)，實驗室室溫控制為22～25 ℃，濕度控制為43%～55%。

1.2 儀器與試劑

BS-2000M型全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；TSA8000型全自動凝血分析儀，美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。

乙醇，試劑純，東莞市勛業(yè)化學試劑有限公司；鹽酸，試劑純，上海純優(yōu)生物科技有限公司；乙酸乙酯，試劑純，天津市永大化學試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，南京化學試劑股份有限公司；聚酰胺；分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，試劑純，國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水，上海遠慕生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

將小鼠分為模型組和CGA組，每組各40只，保持兩組小鼠的生活環(huán)境和飲食等條件完全相同一周后，將乙型溶血性鏈球菌用注射器分別注入模型組和CGA組的小鼠體內。溶血性鏈球菌感染潛伏期在3個月左右，其主要癥狀為咽痛、寒顫、發(fā)熱、惡心嘔吐、咽部腫大、扁桃體腫大以及頸部淋巴結腫大。當兩組小鼠出現(xiàn)發(fā)熱、寒顫、惡心、嘔吐以及動作頻繁等癥狀時，用注射器吸取適量生理鹽水，注入模型組小鼠體內；用注射器吸取適量CGA水溶液（劑量5 mg/kg）注入CGA組小鼠體內。

CGA提取方法：（1）稱取金銀花50 g加入到1 000 mL的圓底燒瓶中，并加入500 mL（10倍量）70%的乙醇，于75 ℃冷凝回流3 h，倒出液體，再用400 mL（8倍量）、400 mL（8倍量）回流2次，每次2 h，過濾，合并濾液，然后在80 ℃條件下濃縮濾液或者用旋蒸儀旋干濾液至無醇味。（2）分離純化。以濃度為6 mol/L的鹽酸溶液調pH值至3.0左右，以3倍量的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液（乙酸乙酯層），以5%的氫氧化鈉溶液調萃取液pH至8.0左右，分取水層減壓濃縮。用聚酰胺拌樣，用聚酰胺（80～100目）裝柱（用量大概為綠原酸粗品的5倍），裝入柱徑與柱長比為1∶7的層析柱中，常壓下用10%的乙醇作為洗脫劑洗脫，收集流分，點樣與標準品對照（標準品用50%的甲醇溶解，0.2 mg/mL），合并相同流分，旋干即為所要提取的綠原酸。使用時，將提取的綠原酸稀釋到5 mg/kg濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 指標測定

用全自動生化檢測儀定量檢測C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量。用全自動凝血分析儀測定白細胞計數(shù)（White blood cell count，WBC）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）水平。

1.5 統(tǒng)計分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計分析。兩組計量資料進行正態(tài)性檢驗后進行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 兩組小鼠凝血功能相關指標的比較

由表1可知，CGA組FIB含量低于模型組，PT、APTT、TT高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明金銀花提取物CGA干預后的模型組其凝血功能各項指標均有積極好轉，這是因為CGA可在一定程度清除和抑制溶血性鏈球菌的生長和繁殖，從而緩解血小板的異?；罨?，最終改善小鼠凝血功能，同時其對小鼠凝血功能的影響可能還與其有效緩解內皮細胞損傷，最終積極改善血小板聚集有關。

表1 兩組小鼠凝血功能相關指標的比較（±s）

表1 兩組小鼠凝血功能相關指標的比較（±s）

組別 PT/s FIB/（g/L） APTT/s TT/s模型組（n=40）9.51±1.29 4.51±0.84 22.17±4.02 15.04±1.96 CGA組（n=40）12.04±1.63 2.60±0.32 28.69±4.71 17.82±2.34 t 7.697 13.438 6.659 5.760 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 兩組小鼠血清炎癥相關指標的比較

由表2可知，CGA組小鼠CRP含量高于模型組，IL-6、TNF-α、IL-1β、WBC含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IL-6是由T淋巴細胞、成纖維細胞等分泌產生的一種促炎細胞因子，在炎癥初期IL-6會在病變位置大量合成并且由血液進入肝臟，誘導機體在短時間內大量合成CRP、SAA等相關蛋白[6]。具體分析CGA組小鼠IL-6的變化特征，主要與CGA作為AMPK/Nrf2通路的激活劑，通過抑制NF-κB、JAK-1、STAT-1和MAPK通路的磷酸化，從而對脂多糖誘導作用進行抑制，達到抑制急性和慢性炎癥反應作用有關。此次研究中發(fā)現(xiàn)溶血性鏈球菌感染會導致小鼠血清中IL-6明顯升高，CGA干預后IL-6的表達降低，CGA降低IL-6表達效果好，說明CGA具有較強的抗炎作用。同時，鏈球菌感染小鼠模型制作過程中，溶血性鏈球菌感染會導致體內促炎因子如IL-6和TNF-α和iNOS大量增加，互相促進導致炎癥因子的進一步增加，從而損害體內各個器官。尤其是TNF-α作為免疫系統(tǒng)的主要調節(jié)因子，通過其TNFR1激活和召集免疫細胞，在炎癥的傳播中發(fā)揮重要作用。而CGA主要作用于機體免疫系統(tǒng)，能有效增強免疫系統(tǒng)能力，對上皮淋巴細胞和腸道固有層淋巴細胞中INF-γ和TNF-α水平有一定影響。因此，CGA對鏈球菌感染小鼠發(fā)揮抗炎影響的機制不局限于信號通路，還可影響人體免疫功能的漸變或強化，最終發(fā)揮干預效果。

表2 兩組小鼠血清炎癥相關指標的比較（±s）

表2 兩組小鼠血清炎癥相關指標的比較（±s）

組別 CRP/（μm/mL） IL-6/（ng/L） TNF-α/（ng/L） IL-1β/（pg/mL） WBC/（×109/L）模型組（n=40） 45.63±2.51 75.54±5.01 68.16±4.27 75.26±6.33 14.75±2.17 CGA 組（n=40） 51.86±2.76 60.14±4.55 51.32±3.19 55.24±4.17 12.36±1.63 t 10.561 14.391 19.982 16.704 5.569 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 討論

基于其藥理和生理層面的優(yōu)異表現(xiàn)，可嘗試將該藥材作為藥食同源食材進行推廣應用。但是該研究亦有一定不足之處，僅進行了空白組和實驗組的設計，缺乏條件對照組，因此僅能驗證CGA對鏈球菌感染的干預效果，但無法同其他抗炎或抗菌藥物的效果進行組間比較。

3 結論

本研究通過溶血性鏈球菌感染的小鼠模型，探究了金銀花提取物綠原酸對小鼠凝血功能和炎癥反應相關指標的影響。結果表明，綠原酸可有效改善溶血性鏈球菌感染小鼠的凝血功能和炎癥反應。