一種凍干型人凝血因子Ⅷ制備方法的研究

劉環(huán)，陳紅霞，李勇，鄒越，孫振宇*

（1.國藥集團上海血液制品有限公司，上海 200051；2.國藥集團上海血液制品有限公司云南分公司，云南昆明 650000）

人凝血因子Ⅷ（Human Coagulation Factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ）是人血液中的一種重要的凝血因子，是治療甲型血友病的特效藥。沉淀法是生產(chǎn)FⅧ制劑的傳統(tǒng)方法，如甘氨酸沉淀法、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法和鹽析沉淀法等，沉淀法具有操作簡單、快速、經(jīng)濟的特點，但是僅采用沉淀法獲得的FⅧ純度較低，比活性小于10.0 IU/mg，并且含有大量雜蛋白，臨床使用不良反應大，難以滿足市場和臨床需求?！吨腥A人民共和國藥典（2020版）》三部（以下簡稱“藥典三部”）規(guī)定FⅧ制品的比活性應不低于10.0 IU/mg[1]。鑒于此，國內學者引入離子交換層析技術純化FⅧ，不僅可獲得較高純度的FⅧ制品，還能有效去除大部分雜蛋白和化學物質，在很大程度上提高了FⅧ產(chǎn)品的質量[2-4]。本研究采用PEG沉淀結合離子交換層析法制備出一種凍干型FⅧ，該技術能實現(xiàn)較高的回收率和比活性，且產(chǎn)品穩(wěn)定性和重復性好，適用于規(guī)?；a(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人血漿冷沉淀：國藥集團上海血液制品有限公司按《中華人民共和國藥典（2020版）》三部和企業(yè)制檢規(guī)程制備，每批次血漿冷沉淀投料量為30 kg。

肝素鈉（注射級），上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司；PEG 4000，化學純，國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸、無水氯化鈣、磷酸三丁酯（TNBP）、鹽酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉，分析純，江蘇省勤奮藥業(yè)有限公司；枸櫞酸鈉、蔗糖，藥用級，湖南爾康制藥股份有限公司；聚山梨酯80（Tween-80），藥用級，德國Merck公司；甘氨酸，藥用級，天津天藥藥業(yè)股份有限公司；層析介質（Toyopearl DEAE-650M），日本Tosoh公司。

1.2 儀器與設備

HAPRLESS AS-26離心機，日本巴工業(yè)株式會社；AKTAprocess蛋白質純化系統(tǒng)，美國GE公司；STA Compact全自動血凝儀，法國STAGO公司；LC300層析柱，榮捷生物工程(蘇州)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 FⅧ的制備工藝流程

FⅧ制備的具體工藝流程如圖1所示。

圖1 制備FⅧ的工藝流程圖

1.3.2 FⅧ制品的檢測

1.3.2.1 蛋白含量檢測

按照藥典三部通則0731第二法Lowry法進行檢測。

1.3.2.2 效價檢測

用STA Compact全自動血凝儀對制備的FⅧ進行檢測，血凝儀的讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為受檢FⅧ的效價。

1.3.2.3 其他相關檢測

按照藥典三部的相關要求，分別對成品進行物理檢查和化學檢定。

1.3.3 相關指標的計算

1.3.3.1 成品比活性計算

成品比活性計算公式為FⅧ比活（IU/mg）=FⅧ效價（IU/mL）÷蛋白含量（mg/mL）。

1.3.3.2 FⅧ各級回收率計算

FⅧ各級回收率計算公式為FⅧ各級回收率=（該級總效價÷上樣液總效價）×100%。

2 結果與分析

2.1 FⅧ各級回收率

從上樣液開始計算，F(xiàn)Ⅷ洗脫、除菌過濾、凍干和干熱病毒滅活后各級回收率計算結果如圖2所示，平均值分別為75.66%、66.73%、62.98%和60.45%。由于上樣流穿液和洗滌流穿液中可能含有部分FⅧ，且一些結合力較強的FⅧ牢固地吸附在凝膠顆粒上未能被有效洗脫，導致洗脫步驟會有一定的活性損失。除菌過濾操作中部分FⅧ殘留在濾器內不能有效回收且除菌過濾壓力較大使得FⅧ活性損失。凍干操作雖能使絕大部分蛋白活性保留下來，提高蛋白的穩(wěn)定性，但其脫水和降溫過程均會對FⅧ活性造成影響。干熱病毒滅活是對凍干后FⅧ制品在98～100 ℃沸水浴中進行30 min的熱處理，能有效滅活非脂包膜病毒，同時也對制品的活性產(chǎn)生了一定的影響[5]。

圖2 FⅧ各級回收率結果

2.2 FⅧ成品物理檢查

FⅧ外觀和復溶時間情況見表1。結果顯示，離子交換層析法純化的FⅧ凍干后外觀成型較好，符合藥典三部的要求，用滅菌注射用水復溶后，復溶后外觀均為無色澄明液體，復溶時間小于30 min。

表1 FⅧ成品物理檢查結果

2.3 FⅧ成品化學檢定

PEG是前期FⅧ粗制提純的主要化學試劑，Tween-80和TNBP是S/D滅活劑的主要成分，其作用是破壞含脂質的病毒包膜而使其失去傳染性或復制能力，能有效去除HIV、HBV和HCV等脂包膜病毒[5]?；瘜W檢定結果如表2所示，3種化學物質平均殘留量分別為46.0 μg/mL、3.30 μg/mL和0.043 g/L，均滿足藥典規(guī)定，表明離子交換層析技術能有效控制化學物殘留量。

表2 FⅧ成品化學檢定結果

2.4 FⅧ成品比活性

比活性是制備FⅧ工藝過程中的關鍵指標，通過檢測FⅧ成品的效價和蛋白含量來計算比活性，結果如表3所示。FⅧ比活性平均值為70.17 IU/mg，SD值為7.07 IU/mg，RSD值為10.08%，該結果與國內某公司的研究結果（69±11）IU/mg相仿[4]。表明該工藝能制備高比活性的FⅧ，且穩(wěn)定性和重復性較好。

3 結論

本研究釆用PEG沉淀結合離子交換層析法開展3批次連續(xù)實驗，從人血漿冷沉淀中提取FⅧ。研究中首先分析了洗脫、除菌過濾、凍干和干熱病毒滅活工藝的FⅧ活性回收率情況，結果表明從上樣液開始計算，各級回收率平均值分別為75.66%、66.73%、62.98%和60.45%。研究中還對FⅧ成品進行了物理檢查和化學檢定，其結果均符合藥典標準。最后對FⅧ比活性進行了分析，其平均值為70.17 IU/mg，RSD值為10.08%。綜上所述，本文實驗方法不僅能從血漿冷沉淀中提取出高比活性的FⅧ，還能有效去除化學物殘留，且工藝穩(wěn)定可靠，適用于FⅧ的規(guī)?；a(chǎn)。