張瑞強，馬國虎，繁萍，駱寅梅，趙永智，冶蕊，巨雪燕，董芊里

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

青海地區(qū)放牧家畜的消化道寄生線蟲主要以奧斯特線蟲、細頸線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、夏伯特線蟲和毛首線蟲等為主，引起家畜慢性消耗性疾病[1-3]，降低飼料的有效利用率[4]。傳統(tǒng)的家畜線蟲檢測方法分為形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)方法等[5]，這些方法的不足之處是檢測目標(biāo)單一，工作量大和對動物損傷度高?，F(xiàn)代獸醫(yī)診斷學(xué)的發(fā)展趨勢是微創(chuàng)或無創(chuàng)精準(zhǔn)檢測，而且基于動物群體龐大的實際狀況能通過群體的檢測來降低工作量。糞便是許多寄生蟲生活史或一過性停留的載體，是開展多種寄生蟲病原高通量檢測的較理想樣本。2018年底，Cannon等[6]用改進的擴增子技術(shù)分析了人源和環(huán)境源樣本中的單細胞和寄生生物，測序平臺通過使用優(yōu)化的聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)，在DNA聚合酶的催化下，DNA分子錨和熒光標(biāo)記核苷酸進行聚合，在激光的作用下熒光信號被激發(fā)，隨后高分辨率成像系統(tǒng)對光信號進行采集，光信號經(jīng)過數(shù)字化處理后，獲得當(dāng)前待測堿基的信息，從而完成測序，該技術(shù)為開展寄生蟲群體檢測研究提供了思路。

本研究選用參考文獻[6,7]中的兩對線蟲引物，以青海省內(nèi)不同地區(qū)的牦牛和藏羊糞便樣本為研究對象，初步探索了基于聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)的高通量測序檢測方法在寄生線蟲上的檢測效果，對家畜糞便中線蟲種系進行了分析鑒定。

1 材料

1.1 糞便樣本

2021年8月在青海省海晏、貴南、澤庫和河南四縣，共采集了155份牦牛和藏羊糞便樣本，低溫運送回實驗室保存。各縣不分動物種隨機取樣2份，每份樣本約10 g，共8份混勻成1份，然后分裝后分成3份，干冰保存寄送上海美吉生物公司。

1.2 試劑

磁珠法糞便DNA提取試劑盒、糞便DNA樣本保存管、M5 Marker i DNA Marker與2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix (with blue dye) 購買于北京聚合美生物科技有限公司。GeneGreen核酸染料與瓊脂糖購買于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物

用于鉤蟲基因PCR的引物如下：5'-CTTTGTCGGGAAGGTTGG-3'與5'-TTCACCACTCTAAGCGTCT-3'[7]；線蟲錨定高通量測序引物A序列如下：5'-CACCCGTGAGGATTGACAG-3'與5'- CGATCACG'GAGGATTTTCA-3'[6]；線蟲錨定高通量測序引物B序列如下：5'-CGTCATTGCTGCGGTTAAAA-3'與5'-CCGTCCTTCGAACCTCTGAC-3'[6]；4對引物委托賽默飛旗下Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 基因組提取

選取糞便樣本約220 mg，按照磁珠法糞便DNA提取試劑盒說明書進行操作。

2.2 測序

錨定高通量測序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥有限公司完成，測序工作包括樣本DNA質(zhì)檢、樣本DNA建庫和上機測序、初始序列優(yōu)化及注釋等。

2.3 PCR擴增及電泳檢測

PCR反應(yīng)體系：樣本基因組DNA 1.0 μL，正反向引物(10 nM)各1.0 μL，2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 10.0 μL，補ddH2O至20.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 Sec，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 sec，循環(huán)35次；再72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。100 bp～750 bp的DNA Maker和樣品各使用5.0 μL，電泳電壓不超過80 V，電泳結(jié)果拍照片，并用photoshop 6.0加標(biāo)注。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)出填寫到表格中，運用 Microsoft Office Excel軟件處理實驗數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 錨定高通量測序結(jié)果

通過對兩對線蟲特異性引物做錨定高通量測序發(fā)現(xiàn)，青海四縣區(qū)糞便樣本DNA的擴增結(jié)果如圖1和圖2，各樣本均有不同長度的擴增條帶。經(jīng)高通量測序后注釋的生物分類如表1，其中已確認(rèn)的動植物線蟲檢出率為37.34%，屬于家畜已知的寄生線蟲為鉤口屬和血矛屬。

圖1 錨定高通量測序引物擴增結(jié)果

圖2 四縣區(qū)內(nèi)樣本中生物屬水平群落豐度

錨定高通量引物是基于18 S rDNA設(shè)計，基本覆蓋大多數(shù)已知線蟲[6]，兩對引物的測序結(jié)果共156條有效OTU，確認(rèn)屬的線蟲OTU數(shù)為36。有8個已知細菌屬，其余均為未知生物序列。

表1 錨定高通量測序結(jié)果

3.2 PCR擴增的電泳結(jié)果

鉤口屬引物為文獻報道[7]的特異性引物，可以區(qū)分多種不同動物源鉤蟲種。PCR擴增結(jié)果如圖3，目的片段大小如文獻敘述，介于404bp-408bp間。

圖3 鉤口屬片段擴增結(jié)果1-7、9、11、12和16判定為陽性結(jié)果，M為Marker

3.3 四縣區(qū)樣本擴增陽性率

海晏縣2份牦牛樣本、6份藏羊樣本呈陽性；貴南縣沒有陽性樣本；澤庫縣1份牦牛樣本、2份藏羊樣本呈陽性；河南縣4份牦牛樣本呈陽性。圖3是四縣區(qū)部分糞便樣本中鉤口屬線蟲的PCR擴增結(jié)果，陽性樣本擴增目標(biāo)條帶與預(yù)期片段大小相似。

各縣區(qū)全部牦牛和藏羊樣本中鉤口屬線蟲總的陽性率為9.68%，其中河南縣牦牛和藏羊全部糞便的陽性率為6.90%，澤庫縣牦牛和藏羊全部糞便的陽性率為8.82%，貴南的為0，海晏縣最高，為25%，顯著高于其他地區(qū)(p<0.01)。從動物陽性率看，鉤口屬線蟲在牦牛中的陽性率(8.33%)低于在藏羊中的陽性率(11.27%)(p<0.05)。

表2 各縣區(qū)樣本陽性率統(tǒng)計表

4 討論

本研究基于消化系統(tǒng)內(nèi)寄生蟲種類多的常識，以高通量測序技術(shù)為依托，初步探索限定于小范圍的寄生蟲種群或單細胞種群的引物檢測效果[6]，進行檢測試驗。因引物特別錨定于小范圍寄生蟲群及一些單細胞生物群，與常規(guī)擴增子針對特定序列片段有明顯的區(qū)別，所以稱為錨定高通量測序。本研究首選了針對線蟲的引物，對青海省內(nèi)四縣采集的動物糞便樣本做錨定高通量測序檢測，結(jié)果中的156個有效操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)，確認(rèn)屬的線蟲OTU數(shù)為36個，集中于鉤口屬和血矛屬。還有8個已知細菌屬，應(yīng)該屬于錯誤擴增測序，其余OTU均為未知生物序列。因此有效的檢出率為37.34%，這個效率從數(shù)字上來看并不高，因為有112個OTU為未知生物，即可檢索物種數(shù)據(jù)庫中沒有相關(guān)生物記錄。

再從線蟲角度來看，我們選用的引物擴增范圍是線蟲，沒有動物源和植物源的區(qū)分；加上本研究所用糞便樣本為放牧的草食家畜，糞便中出現(xiàn)植物線蟲不可避免，所以檢出線蟲的效率不能僅限于動物源線蟲，因此從已知線蟲的數(shù)據(jù)庫比對來說 這種錨定高通量測序在寄生蟲檢測中有很好的優(yōu)勢。

本研究中，可確認(rèn)屬的動物源線蟲主要是鉤口屬和血矛屬，這兩種線蟲均屬于人獸共患病原[8]。已知牛羊可作為鉤蟲的轉(zhuǎn)續(xù)宿主[9]，人生食了這類含有蟲卵的牛羊肉食品，極易感染。為了進一步驗證動物線蟲的檢出準(zhǔn)確性，選用已有文獻中驗證的鉤蟲屬引物[7]，對樣本中鉤蟲進行PCR擴增，155份樣本中有9.38%擴增陽性，總體陽性率不高；其中牦牛樣本陽性率為8.33%，而藏羊樣本的陽性率為11.27%，高于牦牛樣本。從縣區(qū)來看，海晏縣樣本陽性率(25%)高于其他縣的樣本陽性率，而貴南縣陽性率為零。已知這些縣區(qū)都在不同時間建立了有機牧場，發(fā)展有機畜牧業(yè)，從時間上來看，貴南縣、河南縣和澤庫縣建立時間較長，有機牧場的建立與線蟲的陽性率可能存在一定關(guān)聯(lián)，還需要深入研究?？傊?，本研究結(jié)果一方面初步驗證了錨定高通量測序在限定范圍內(nèi)寄生蟲檢測中有較好的鑒定分析效果，另一方面也提示本研究樣本采集地區(qū)應(yīng)加強鉤口屬和血矛屬線蟲的預(yù)防，從而阻斷相關(guān)寄生蟲病的發(fā)生和傳播。