姜釗，張景瑜，張衛(wèi)花，孔秀梅，姜一，冀旭，趙勤

（1.西藏民族大學(xué) 西藏藏醫(yī)藥研究中心藏藥活性成分及藥理機(jī)制研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712082；2.西藏民族大學(xué) 藥材檢測(cè)技術(shù)教育部工程研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712082；3.西藏民族大學(xué) 高原生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)挖掘與生物信息學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712082；4.滄州市中心醫(yī)院病理科，河北 滄州061000）

《本草綱目》中記載，秦艽出秦中，以根作羅紋交糾者佳，故名秦艽[1]，中藥中常用秦艽為龍膽科龍膽屬植物秦艽（Gentiana macrophyllaPall.）、麻花秦 艽（GentianastramineaMaxim.）、粗 莖 秦 艽（GentianacrasicaulisDuthie ex Burk）或 小 秦 艽（GentianadahuricaFisch.）的干燥根。其具有抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝臟、心腦血管疾病防治、免疫抑制、消化促進(jìn)、抗流感、抗腫瘤等作用，在風(fēng)濕病、骨關(guān)節(jié)病、腦出血后遺癥、肛腸疾病、面神經(jīng)炎、皮膚病、婦科疾病、應(yīng)變性亞敗血癥等疾病治療方面都有顯著療效[2-3]。近代藥理研究證實(shí)，秦艽主要藥用成分為龍膽堿A、B、C，龍膽次堿，秦艽丙素及龍膽苦苷[4]，因此藥用價(jià)值極高。1985年及2000年版《中華人名共和國(guó)藥典》中規(guī)定，只有秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽和小秦艽可以入藥[5]，而在秦艽的中藥市場(chǎng)中其相近相似混偽品較多，如烏頭屬牛扁（Aconitumochranthum）、兩色烏頭（Aconitumalboviolaceum）、鼠尾草屬甘西鼠尾草（Salviaprzewalskii）、金蓮花屬 短 瓣 金 蓮 花（Trolliusledebouri）、黃 秦 艽（Veratrilla baillonii）、西 藏 黑 秦 艽（Gentiana wallonii）、中亞秦艽（Gentiana kaufmanniana）等[6]。使得秦艽的鑒別和藥效研究極為困難，也影響了秦艽的推廣和開(kāi)發(fā)。

DNA條形碼技術(shù)由于其快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)在中藥材的分類(lèi)鑒定中有著廣闊的前景。常用中藥材鑒定條形碼有ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等基因序列[7-8]，羅焜等[6]利用ITS2對(duì)采自陜西、甘肅、云南、西藏等地的秦艽樣品進(jìn)行基源研究，鑒定效果顯著。前期利用ITS2基因?qū)υ囼?yàn)樣品進(jìn)行鑒定，序列比對(duì)結(jié)果均為非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum），鑒定時(shí)易受真菌干擾。而psbAtrnH序列是葉綠體中位于編碼光合系統(tǒng)II反應(yīng)中心的psbA基因和編碼tRNA組氨酸的trnH基因間的一段非編碼序列[9]，變異位點(diǎn)較多，相較于編碼區(qū)序列具有更豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息[10]，且葉綠體基因在非編碼區(qū)存在較高核苷酸置換率[11]，分辨率更高，可廣泛用于中草藥的分子研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)，西藏地區(qū)麻花秦艽對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)性和繼發(fā)性病變足腫脹均有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)缺氧小鼠具有抗缺氧和抗氧化的作用[12-13]。西藏、青海、四川等地3 000 m左右高海拔地區(qū)均有野生秦艽分布，而大多數(shù)生長(zhǎng)在高海拔地區(qū)藥材處于氧含量低、日照強(qiáng)的環(huán)境中，其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有很好的抗氧化作用[14]。

為更好地進(jìn)行3個(gè)地區(qū)秦艽混偽品的區(qū)分和藥效差異分析，本試驗(yàn)選取西藏、青海、四川地區(qū)5個(gè)樣品，利用psbA-trnH序列在分析樣品分類(lèi)地位的基礎(chǔ)上，檢測(cè)其所含龍膽苦苷的含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率，以此評(píng)估試驗(yàn)藥材的藥效及抗氧化能力，旨在為秦艽藥材的利用和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)藥材的鑒定和藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)的5種樣品分別為采自青海、四川和西藏3個(gè)省份5個(gè)地區(qū)的秦艽植物干燥根（表1）。所有樣品均為野生藥材，樣品收集后自然晾干保存。

表1 材料來(lái)源及psbA-trnH序列信息Tab.1 The materials source and psbA-trnH sequences information

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 將收集的干燥根粉碎碾磨，每個(gè)樣品選取2個(gè)重復(fù)，稱取0.5 g，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取植物基因組DNA。PCR擴(kuò)增依照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，采用psbA-trnH序列引物[15]（psbA F：5'-GTT ATGCATGAACGTAATGCTC-3'；trnH R：5'-CG CGCATGGTGGATTCACAATCC-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μL: 5×Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，正、反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 14.75 μL。序列擴(kuò)增程序?yàn)?4 °C預(yù)變性5 min；94 °C變 性30 s，60 °C退 火30 s，72 °C延 伸35 s，33個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min。

擴(kuò)增后，采用凝膠電泳檢測(cè)，之后使用DNA凝膠回收試劑盒（GE0101）進(jìn)行DNA片段的純化回收并送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 分子進(jìn)化分析 測(cè)序公司返回?cái)?shù)據(jù)利用SeqMan軟件去除引物和低質(zhì)量序列，并且進(jìn)行拼接。將拼接的序列通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列相似性分析，同時(shí)下載序列相似度較高序列為參比序列，采用Clustal X軟件[16]進(jìn)行多序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果通過(guò)MEGA 7.0[17]計(jì)算遺傳距離（K2P）并利用鄰近法（Neighbor-Joining）[18]，采用雙參數(shù)模型（Two-parameter model）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并采用Bootstrap 1 000次檢驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可靠性評(píng)估。

1.2.3 樣本龍膽苦苷含量檢測(cè) 樣品使用高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)0.15 mm篩，稱取藥粉粉末約0.1 g，加入20 mL的甲醇，超聲40 min后冷卻，負(fù)壓過(guò)濾去除藥渣后檢測(cè)，各3個(gè)重復(fù)。利用紫外分光光度法[19]對(duì)環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物中龍膽苦苷的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行200～700 nm掃描測(cè)定，并找到測(cè)定的最大吸收峰，將標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8 mg/L，搖勻，在最大吸收峰處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度及各標(biāo)準(zhǔn)品濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)選取樣品經(jīng)甲醇稀釋后進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率的檢測(cè)[19]。檢測(cè)后的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算龍膽苦苷濃度。

1.2.4 樣本抗氧化能力分析（DPPH清除率測(cè)定） 參考陳瀚等[20]、吳宏偉等[21]研究方法，用95%乙醇配制DPPH貯備液，濃度2.0×10-4mol/L，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)0.15 mm篩，精密稱取0.1 g樣品并加入95%乙醇10 mL，超聲處理30 min，補(bǔ)齊揮發(fā)的乙醇體積。吸取1 mL稀釋100倍后作為待測(cè)液。將每種樣品溶液和DPPH等體積分別加入96孔板中，反應(yīng)體系0.2 mL為樣品組（As）。以等體積95%乙醇為對(duì)照組（Ac），蒸餾水為空白組（Ao）。加樣后輕揉振蕩96孔板，充分溶解后避光放置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處檢測(cè)OD值。計(jì)算供試品溶液的DPPH自由基清除率，每組5個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用軟件Excel 2010及R 4.1.2進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖；同時(shí)利用SPSS 17.0中LSD最小顯著差異法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 psbA-trnH序列長(zhǎng)度、GC含量及序列差異

測(cè)序后的原始序列拼接后，經(jīng)過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和多序列比對(duì)后得到了psbA-trnH序列全長(zhǎng)，5個(gè)樣品基因長(zhǎng)度為315～392 bp，GC含量在20.32%～23.21%，每個(gè)樣品的2個(gè)重復(fù)序列及比對(duì)結(jié)果一致，完整序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，基因序列號(hào)及相關(guān)信息如表1所示，樣品序列與GenBank下載的對(duì)照序列經(jīng)多序列比對(duì)后，利用MEGA 7.0進(jìn)行K2P距離計(jì)算，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，樣品XZ-001、XZ-003、SC-001與參比序列粗莖秦艽（KY595461.1）的psbA-trnH序列兩兩之間的遺傳距離均為0.000，說(shuō)明西藏林芝、拉薩和四川收集的以上3個(gè)樣品序列與粗莖秦艽psbA-trnH序列無(wú)差異，應(yīng)屬于粗莖秦艽；樣品XZ-002測(cè)序序列與麻花秦艽（KJ657732.1）的psbAtrnH序列之間的遺傳距離為0.000，與粗壯秦艽（Gentiana robustaKT159969.1）遺傳距離為0.003，說(shuō)明XZ-002更接近于以上2個(gè)物種，應(yīng)屬于麻花秦艽；樣品QH-001與黃管秦艽（Gentiana officinalisMH261261.1）遺傳距離為0.000，說(shuō)明采自青海樣品應(yīng)為黃管秦艽。

表2 樣品序列與參考序列的K2P距離Tab.2 The K2P distance of sample sequences and reference sequences

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于psbA-trnH序列構(gòu)建試驗(yàn)樣品與相近物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（NJ）如圖1所示。

圖1 基于psbA-trnH序列構(gòu)建試驗(yàn)樣品與相近物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（NJ）Fig.1 The phylogenetic tree（NJ） constructed by test samples and neighboring species based on psbA-trnH sequences

將試驗(yàn)序列及GenBank得到的參考序列共14條序列經(jīng)過(guò)統(tǒng)一比對(duì)，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（NJ），結(jié)果顯示（圖1），5個(gè)樣品分別聚為3支，其中，采自西藏林芝（XZ-001）、拉薩（XZ-003）、四川（SC-001）3個(gè)樣品與粗莖秦艽聚為一支，自展值為95%；XZ-001與粗莖秦艽，SC-001與XZ-003相似性分別為100%，SC-001、XZ-003與XZ-001、粗莖秦艽相似性為99.48%。由此表明，XZ-001應(yīng)為粗莖秦艽，SC-001、XZ-003為同一物種，雖與粗莖秦艽相似性為99.48%，個(gè)別基因位點(diǎn)有差異，但還沒(méi)有到種及以上級(jí)別的區(qū)分度，因此該2個(gè)樣品應(yīng)屬于粗莖秦艽。西藏昌都樣品XZ-002與麻花秦艽、粗壯秦艽聚為一支，自展值為73%，并且XZ-002與麻花秦艽基因相似性為100%，因此，確定樣品XZ-002為麻花秦艽。青海樣品QH-001與黃管秦艽聚為一支，自展值為70%，基因相似性為100%，故此，青海樣品QH-001為黃管秦艽，5個(gè)樣品的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與序列的K2P距離分析結(jié)果一致。

2.3 樣品龍膽苦苷含量測(cè)定

龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品全波長(zhǎng)掃描確定在波長(zhǎng)270 nm有最大吸收峰，按照試驗(yàn)濃度檢測(cè)吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程Y=27.550 0X+0.083 1，r=0.998），結(jié)果顯示，龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品在濃度為7.2～28.8 mg/L范圍內(nèi)與吸光度值保持良好的線性關(guān)系。樣品反復(fù)測(cè)量6次，結(jié)果顯示，測(cè)量方法精密度良好（RSD=0.01%），穩(wěn)定性良好（RSD=1.26%），重復(fù)性可靠（RSD=1.63%），每份樣品甲醇稀釋到不同濃度后，向其中精密加入已知濃度的適量龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻后檢測(cè)其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本回收率為99.12%（RSD=0.85%），表明該方法回收率良好。

樣品龍膽苦苷濃度檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，5個(gè)樣品龍膽苦苷濃度在8.56%～12.76%，其中青海的黃管秦艽（QH-001）含量最高（12.76%），西藏昌都（XZ-002）麻花秦艽含量其次（10.47%），采自西藏林芝、拉薩及四川的3個(gè)粗莖秦艽樣品（XZ-001、XZ-003、SC-001）含量較低，都在9%左右，且3個(gè)樣品龍膽苦苷含量無(wú)顯著性差異。研究表明，龍膽苦苷具有減少急性肺損傷引起的肺內(nèi)炎癥細(xì)胞及滲出物增多的作用，還可抑制炎癥因子改善小鼠結(jié)腸炎損傷，并且還具有抑制肝癌細(xì)胞、抗癲癇等作用[22-23]。藥典規(guī)定，秦艽藥材干燥品龍膽苦苷（C16H20O9）總量不少于2.5%[24]，而本次試驗(yàn)樣品龍膽苦苷含量均超過(guò)9%，遠(yuǎn)超藥典規(guī)定，開(kāi)發(fā)價(jià)值巨大。

圖2 試驗(yàn)樣品龍膽苦苷含量及DPPH自由基清除率Fig.2 Gentiopicroside content and DPPH scavenging rate of test samples

2.4 樣品DPPH清除率結(jié)果測(cè)定

測(cè)定5個(gè)樣品的DPPH清除率，結(jié)果表明（圖2），3個(gè)已知品種中麻花秦艽＞黃管秦艽＞粗莖秦艽，即XZ-002＞QH-001＞XZ001；值得注意的是，2個(gè)粗莖秦艽相似種XZ-003的DPPH清除率優(yōu)于麻花秦艽，SC-001的清除率則介于麻花秦艽和黃管秦艽之間，且所有樣本之間差異極顯著（P＜0.01）。整體而言，5個(gè)樣品DPPH清除率為66.49%～90.68%，其中西藏林芝的粗莖秦艽近源種DPPH清除率達(dá)到90.68%。本試驗(yàn)5個(gè)樣品DPPH自由基清除率均在60%以上，抗氧化能力強(qiáng)，可能與高海拔及野生環(huán)境的生長(zhǎng)條件相關(guān)，需進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論與討論

ITS基因及葉綠體多基因片段被用于西藏、甘肅等不同地區(qū)各類(lèi)秦艽及其近緣種鑒定，發(fā)現(xiàn)ITS序列無(wú)法鑒別粗壯秦艽及麻花秦艽[25-26]。本研究采用psbA-trnH序列對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行分子鑒定，根據(jù)基因相似性、遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)位置分析，確定試驗(yàn)5個(gè)樣品分屬于3個(gè)秦艽品種，分別為粗莖秦艽（XZ-001、XZ-003、SC-001）、麻花秦艽（XZ-002）和黃管秦艽（QH-001）。同時(shí)采用ITS2基因的分子鑒定發(fā)現(xiàn)，所測(cè)得的ITS2基因比對(duì)結(jié)果均為非洲哈茨木霉，相似性為100%，表明測(cè)序的干燥根中含有大量非洲哈茨木霉。根據(jù)羅焜等[6]對(duì)秦艽基源研究?jī)?yōu)化的試驗(yàn)方法，試驗(yàn)前期我們用75%乙醇進(jìn)行表面清洗，但依然無(wú)法解決，可能本次試驗(yàn)樣品中有大量?jī)?nèi)生真菌。說(shuō)明ITS2基因序列不適于本試驗(yàn)樣品分子鑒定研究。本次試驗(yàn)樣品根部擁有大量非洲哈茨木霉，可能與秦艽屬植物生長(zhǎng)或者有效藥用成分積累相關(guān)。有研究表明，木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物中有近400種均有生物活性，具有良好的生防效果[27]；同時(shí)，木霉可產(chǎn)生10余種具有廣譜抑菌性的哌珀霉素類(lèi)物質(zhì)[28-29]，這些物質(zhì)在誘導(dǎo)植物抗性和抑菌方面具有重要作用。陳敬師等[30]研究表明，非洲哈茨木霉具有高產(chǎn)抑菌揮發(fā)性有機(jī)物的能力，是一株具有應(yīng)用潛力的生防菌。因此，本次研究試驗(yàn)樣品根部非洲哈茨木霉的分布與植物生長(zhǎng)及藥用成分積累的相關(guān)性需進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)樣品的龍膽苦苷含量測(cè)定顯示，采自青海的黃管秦艽含量最高，麻花秦艽其次，其余3個(gè)粗莖秦艽含量較低。根據(jù)顯著性分析結(jié)果，黃管秦艽、麻花秦艽及粗莖秦艽不同種屬間龍膽苦苷含量差異顯著，檢測(cè)的3個(gè)不同地區(qū)的粗莖秦艽樣品龍膽苦苷含量差異不顯著。而DPPH自由基清除率測(cè)定顯示，拉薩野生粗莖秦艽高達(dá)90%以上，其余藥材自由基清除率相近在70%左右，且5個(gè)樣品兩兩間差異極顯著。劉艷紅等[31]研究發(fā)現(xiàn)，秦艽中多酚具有清除自由基能力，并且含量豐富。在對(duì)藏藥植物抗氧化物質(zhì)篩選中，亦發(fā)現(xiàn)烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷A和烏奴龍膽苷A都有較強(qiáng)的抗氧化能力[32]。丁春發(fā)等[33]研究表明，野生麻花秦艽中龍膽苦苷具有較好的抗氧化能力，但其抗氧化能力的強(qiáng)弱與龍膽苦苷含量不成正比。這些充分說(shuō)明，秦艽類(lèi)植物應(yīng)含有其他抗氧化作用的活性成分。雖然龍膽苦苷含量較高，但抗氧化能力可能有其他成分參與，其有待進(jìn)一步研究探索。最后，本次采集樣品均來(lái)自3 000 m海拔左右，海拔差異600 m左右，差異不大，在后期研究中可以擴(kuò)大海拔梯度采樣，同時(shí)收集相關(guān)環(huán)境因子數(shù)據(jù)，了解藥用成分和抗氧化能力差異與海拔梯度及相關(guān)環(huán)境因子的相關(guān)性。為后續(xù)該類(lèi)藥材的種植和藥效研究提供思路并奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，psbA-trnH序列可很好區(qū)分粗莖秦艽、麻花秦艽和黃管秦艽，不同秦艽種屬間龍膽苦苷含量及抗氧化能力差異顯著，而藥用市場(chǎng)秦艽來(lái)源比較復(fù)雜，利用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合藥效評(píng)價(jià)對(duì)準(zhǔn)確鑒別秦艽藥材、保障臨床用藥安全提供了保障。