袁小波 唐靜

卵巢癌是婦科腫瘤中危害最為嚴(yán)重的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害女性的身體健康,該疾病早期難于診斷,病發(fā)后難于防治[1]。 目前主要通過(guò)手術(shù)治療切除病灶,緩解腫瘤增生,但術(shù)后復(fù)發(fā)概率高[2]。因此,急需開(kāi)發(fā)具有針對(duì)性的治療藥物,提高治療效果,減少疾病復(fù)發(fā)。 女貞子多糖是木樨科植物女貞子的主要有效成分,其具有抗腫瘤作用[3]。據(jù)報(bào)道,女貞子多糖可抑制黑色素瘤細(xì)胞的粘附能力[4]。 但女貞子多糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響鮮有報(bào)道。 此外,表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)/有絲分裂原活性蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是控制細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中最重要的通路之一,可介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化,最終加速細(xì)胞增殖[5-6]。 相關(guān)研究表明,抑制EGFR/MAPK 信號(hào)通路可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲[7]。 而女貞子多糖能否通過(guò)調(diào)控EGFR/MAPK 信號(hào)通路影響卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為尚不明確。 因此,本研究主要探究女貞子多糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

女貞子多糖(批號(hào):20180526)購(gòu)于陜西鴻澤生物工程有限公司,胎牛血清(批號(hào):20150410)購(gòu)于普利萊(北京)基因技術(shù)有限公司,pcDNA3.1-EGFR及其對(duì)照品由吉瑪生物科技有限公司合成,甲基噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(批號(hào):20171107)購(gòu)于上海紀(jì)寧生物科技有限公司,凋亡檢測(cè)試劑(批號(hào):20180923)購(gòu)于翌圣生物科技有限公司,三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗 體 ( 批 號(hào):20171011)、 EGFR 抗 體 (批 號(hào):20161203)、 p-EGFR 抗體(批號(hào):20170621)、p-P38 MAPK 抗體(批 號(hào): 20190517)、 P38 MAPK 抗 體 ( 批 號(hào):20180620)、B 細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(批號(hào):20190527)、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax) 抗 體 (批 號(hào):20171024)及免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗(批號(hào):20180925)購(gòu)于abcam 公司。

1.2 主要儀器

熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司,型號(hào):7500);蛋白凝膠成像系統(tǒng)(上海生工生物公司,型號(hào):HE-120)。

1.3 細(xì)胞來(lái)源

人上皮性卵巢癌HO8910 細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞研究所。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將HO8910 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO8910 細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO8910 細(xì)胞(濃度1×108/L)分別用終濃度為 0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 女貞子多糖處理48 小時(shí),并命名為對(duì)照組、女貞子多糖低劑量組、女貞子多糖中劑量組、女貞子多糖高劑量組。 此外, 另將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO8910 細(xì)胞設(shè)置為pcDNA-EGFR 組(轉(zhuǎn)染pcDNAEGFR)、 女 貞 子 多 糖 + pcDNA-EGFR 組 ( 轉(zhuǎn) 染pcDNA-EGFR 和10 μg/mL 女貞子多糖共同處理)、女貞子多糖+pcDNA 組(轉(zhuǎn)染 pcDNA 和10 μg/mL女貞子多糖共同處理),各組細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)48 小時(shí),每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。

1.5 MTT 法檢測(cè)HO8910 細(xì)胞增殖

將各組細(xì)胞懸液(1×105)在96 孔板中經(jīng)相應(yīng)處理干預(yù)48 小時(shí)后,向每孔加入20 μL MTT,37℃培養(yǎng)4 小時(shí)后將培養(yǎng)液倒出,加入150 μL DMSO,混勻后置于搖床持續(xù)振蕩10 分鐘,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光吸收值,每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HO8910 細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞懸液(1×105)在96 孔板中經(jīng)相應(yīng)處理干預(yù)48 小時(shí)后,離心收集細(xì)胞懸液,用5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 避光孵育 15 分鐘后,再加入500 μL PBS 重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。 細(xì)胞凋亡率(%)= (凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)) ×100%,每組設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 Western blot 檢測(cè) HO8910 細(xì)胞中 EGFR、p-EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)

收集經(jīng)相應(yīng)處理干預(yù)48 小時(shí)后的各組細(xì)胞,用放射免疫沉淀分析法(radio immuno precipit ationassay,RIPA)裂解液提取總蛋白,將蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉后,加入一抗 GAPDH、EGFR、p-EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bcl-2、Bax,均按1 ∶1500 比例稀釋,4℃孵育過(guò)夜。 清洗三次,加入二抗(1 ∶2000),常溫孵育1 小時(shí),清洗3 次,加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(enhanced chemilum inescence,ECL)觀察蛋白顯色情況,Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值,每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,方差齊,所有數(shù)據(jù)通過(guò)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()體現(xiàn),多組間差異用單因素方差分析進(jìn)行比較,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與對(duì)照組相比,女貞子多糖低劑量組、女貞子多糖中劑量組、女貞子多糖高劑量組OD 值、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低,細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05)。 見(jiàn)表1、圖1 ~2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞凋亡的影響

表1 不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(,n=6)

表1 不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(,n=6)

注: 與對(duì)照組相比,aP<0.05;與女貞子多糖低劑量組相比,bP<0.05;與女貞子多糖中劑量組相比,cP<0.05。

0.000 0.000 0.000 0.000組別 OD 值(490 nm) 細(xì)胞凋亡率(%)0.629±0.041 1.28±0.17 1.64±0.18 0.40±0.11女貞子多糖低劑量組 0.478±0.038a 4.84±0.63a 1.29±0.14a 0.78±0.18a女貞子多糖中劑量組 0.384±0.043ab 16.13±1.48ab 0.93±0.21ab 1.26±0.21ab女貞子多糖高劑量組 0.272±0.036abc 24.47±3.73abc 0.55±0.13abc 1.87±0.14abc F 值 87.430 163.751 46.660 89.381 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH對(duì)照組

2.2 不同劑量女貞子多糖對(duì) HO8910 細(xì)胞中EGFR/MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,女貞子多糖低劑量組、女貞子多糖中劑量組、女貞子多糖高劑量組 p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05)。 見(jiàn)表2、圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910細(xì)胞中p-EGFR、EGFR、p-MAPK、MAPK 蛋白表達(dá)量的影響

表2 不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

表2 不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

注: 與對(duì)照組相比,aP<0.05;與女貞子多糖低劑量組相比,b P<0.05;與女貞子多糖高劑量組相比,cP<0.05。

0.000 0.000組別0.83±0.04 0.80±0.05女貞子多糖低劑量組 0.74±0.05a 0.69±0.04a女貞子多糖中劑量組 0.61±0.07ab 0.53±0.06ab女貞子多糖高劑量組 0.21±0.03abc 0.17±0.04abc F 值 181.556 195.161 P 值p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK對(duì)照組

圖2 Western blot 檢測(cè)不同劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)量的影響

2.3 過(guò)表達(dá) EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中EGFR/MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,pcDNA-EGFR 組p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 顯著升高(P<0.05);與女貞子多糖+pcDNA 組相比,女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表3 ~4、圖4。

表3 過(guò)表達(dá)EGFR 對(duì)HO8910 細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響()

表3 過(guò)表達(dá)EGFR 對(duì)HO8910 細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響()

6 0.83±0.04 0.80±0.05 pcDNA-EGFR 組 6 0.94±0.06 0.92±0.06 t 值 -3.734 -3.764 P 值對(duì)照組0.004 0.004 p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK組別 n

表4 過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

表4 過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影響(,n=6)

0.24±0.05 0.19±0.03女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 0.73±0.04 0.56±0.05 t 值 -18.745 -15.543 P 值p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK女貞子多糖+pcDNA 組組別0.000 0.000

圖4 Western blot 檢測(cè)各組HO8910 細(xì)胞中p-EGFR、EGFR、p-MAPK、MAPK 蛋白表達(dá)量

2.4 過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與對(duì)照組相比,pcDNA-EGFR 組 OD 值、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高,細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與女貞子多糖+pcDNA 組相比,女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 OD 值、Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著升高,細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表5 ~6、圖5 ~6。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞凋亡的影響

表5 過(guò)表達(dá)EGFR 對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響(,n=6)

表5 過(guò)表達(dá)EGFR 對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響(,n=6)

0.629±0.041 1.28±0.17 2.14±0.18 0.47±0.11 pcDNA-EGFR 組 0.741±0.068 0.87±0.19 2.49±0.16 0.25±0.07 t 值 -3.455 3.939 -3.560 4.133 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH對(duì)照組組別 OD 值(490 nm) 細(xì)胞凋亡率(%)0.006 0.003 0.005 0.002

表6 過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響(,n=6)

表6 過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響(,n=6)

0.265±0.042 23.88±3.83 0.62±0.11 1.82±0.13女貞子多糖+pcDNA-EGFR 組 0.452±0.048 3.73±0.39 1.67±0.17 0.72±0.14 t 值 -7.182 12.821 -12.702 14.103 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH女貞子多糖+pcDNA 組組別 OD 值(490 nm) 細(xì)胞凋亡率(%)0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 Western blot 檢測(cè)過(guò)表達(dá)EGFR 逆轉(zhuǎn)高劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

卵巢癌是一種發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤,近年來(lái)在我國(guó)發(fā)病率仍較高[8]。 該病可使患者產(chǎn)生強(qiáng)烈的腹部疼痛,引發(fā)多種消化道癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至危害女性生命[9]。 目前僅能通過(guò)手術(shù)加以治療,并通過(guò)藥物進(jìn)行緩解,但能有極高的復(fù)發(fā)率[10]。 開(kāi)發(fā)具有針對(duì)性的治療藥物,抑制卵巢癌組織的生長(zhǎng)和擴(kuò)散,成為當(dāng)前的重中之重[11]。 近年來(lái)隨著中醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展,通過(guò)中藥提取物治療相關(guān)疾病的研究逐漸增多,越來(lái)越多的證據(jù)表明,中藥提取物對(duì)于癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用,推測(cè)部分中藥提取物可用于治療緩解癌癥細(xì)胞的增殖[12-13]。 女貞子屬木樨科,是植物女貞的果實(shí),被證實(shí)具有抗癌效果,目前已被應(yīng)用于開(kāi)發(fā)抗癌藥物,是多種抗癌保健品的成分之一[14]。 相關(guān)研究顯示,女貞子多糖可通過(guò)降低淋巴瘤細(xì)胞表面唾液酸含量來(lái)抑制淋巴瘤進(jìn)展[15],表明女貞子多糖具有抗腫瘤作用。 而女貞子多糖能否抑制卵巢癌進(jìn)展尚不可知。 本研究通過(guò)不同劑量的女貞子多糖處理卵巢癌HO8910細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量女貞子多糖處理后,HO8910 細(xì)胞OD 值顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,且呈劑量依賴性,表明女貞子多糖可加速細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,進(jìn)而抑制卵巢癌進(jìn)展。

有文獻(xiàn)指出,Bax 作為線粒體蛋白,可與線粒體膜結(jié)合,促進(jìn)凋亡因子表達(dá)[16]。 Bcl-2 作為抗凋亡蛋白,可減少凋亡因子的產(chǎn)生,抑制細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量是評(píng)估細(xì)胞凋亡水平的重要依據(jù)[17]。 本研究發(fā)現(xiàn),不同劑量的女貞子多糖處理卵巢癌細(xì)胞后,Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低,Bax 蛋白表達(dá)量顯著升高,表明女貞子多糖通過(guò)調(diào)控Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,但具體的作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步探索。

EGFR 作為常見(jiàn)的細(xì)胞膜受體,廣泛存在于人體多種類型的細(xì)胞中,在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用,可參與啟動(dòng)細(xì)胞周期,加速細(xì)胞繁殖[18]。EGFR 同樣參與癌細(xì)胞的增生,促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生,例如其在卵巢癌組織中高水平表達(dá),被認(rèn)為是評(píng)估卵巢癌惡化程度的重要標(biāo)志[19]。 EGFR 的磷酸化可進(jìn)一步激活MAPK 信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)[20]。 據(jù)報(bào)道,抑制EGFR/MAPK 通路可抑制乳腺癌進(jìn)展[21]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)EGFR 后,EGFR、MAPK 磷酸化程度顯著升高,OD值、Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著升高,細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量顯著降低,表明EGFR/MAPK 信號(hào)通路可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。 此外,有研究表明,以女貞子作為主要成分的中藥可參與調(diào)控EGFR,緩解非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展[22],推測(cè)女貞子多糖可能通過(guò)調(diào)控EGFR/MAPK 信號(hào)通路,抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 本研究顯示,與對(duì)照組相比,不同劑量的女貞子多糖處理卵巢癌細(xì)胞后,EGFR、MAPK 磷酸化程度顯著降低,表明女貞子多糖很可能通過(guò)調(diào)控EGFR/MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮作用,為進(jìn)一步驗(yàn)證女貞子多糖在通路中是否發(fā)揮作用,本實(shí)驗(yàn)在高劑量女貞子多糖處理的同時(shí)再轉(zhuǎn)染pcDNA-EGFR 來(lái)干預(yù)HO8910 細(xì)胞,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)EGFR 減弱了高劑量女貞子多糖對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖的抑制,以及細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用,進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)推論。

綜上所述,女貞子多糖可能通過(guò)抑制EGFR/MAPK 信號(hào)通路,進(jìn)而抑制HO8910 細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 然而,本研究尚存在不足之處,女貞子多糖是否還通過(guò)其他作用通路間接參與調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡,還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以說(shuō)明。