曾 偉，牛永東，張俏忻

（1.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥學部，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫(yī)學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣東 汕頭 515041）

肝細胞癌是全球癌癥相關死亡的第四大常見原因，造成了沉重的疾病負擔[1]。法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）在機體內(nèi)參與膽汁酸合成、代謝、轉(zhuǎn)運，并能夠調(diào)節(jié)重要的靶基因[2]。研究推測其與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，還可能在肝癌細胞中信號通路異常表達方面發(fā)揮著不可或缺的作用[3]。小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP）在許多代謝通路中起調(diào)節(jié)作用；膽汁酸鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）和鈉離子—?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白（Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）影響肝細胞內(nèi)外的膽汁酸平衡；膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1） 和膽固醇12α羥化酶（sterol-12α-hydroxylase，CYP8B1）參與鵝去氧膽酸和膽酸的合成。鵝去氧膽酸為FXR最強有力的配體。肝細胞癌患者、肝硬化患者和健康人血漿中的鵝去氧膽酸水平存在明顯差異[4]，血漿中的鵝去氧膽酸變化水平可作為診斷鑒別肝硬化和肝細胞癌的生物標志物[5]。姜黃素可以有效抑制多種癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，且無明顯毒副作用，為潛在的抗肝細胞癌治療藥物[6]。本研究用鵝去氧膽酸處理HepG2細胞，考察其對FXR、BSEP、SHP、CYP7A1、CYP8B1、NTCP以 及β-catenin等膽汁酸靶基因mRNA的影響，并觀察鵝去氧膽酸和姜黃素對HepG2和SMMC-7721細胞的毒性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和藥物配制MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購于北京索萊寶科技有限公司，胰酶、結晶紫、4%的多聚甲醛購于上海吉至生化科技有限公司。鵝去氧膽酸購于美國MedChemExpress公司，純度≥98.0%，使用DMSO配制成15 mmol/L儲備液，采用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為1、3.3、10、20、30 μmol/L的藥液；姜黃素購于美國MedChemExpress公司，純度≥98.0%，使用DMSO配制成30 mmol/L儲備液，采用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為5、15、30、45、60 μmol/L的藥液。

1.1.2 肝癌細胞株和細胞培養(yǎng)HepG2細胞和SMMC-7721細胞均來自中國科學院上海細胞庫，分別由汕頭大學醫(yī)學院羅文鴻和牛永東課題組凍存保種。在超凈工作臺內(nèi)，先將3 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基加入15 mL的無菌離心管。從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存的肝癌細胞株，在37℃的恒溫水浴箱搖晃至完全溶解，隨后將細胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基吹打混勻后，移入培養(yǎng)皿，在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)期，傳代，留樣凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR測定mRNA的表達水平取對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于6孔板并按濃度梯度加入鵝去氧膽酸，設置對照組。用Trizol法提取RNA，測定RNA質(zhì)量并調(diào)整RNA濃度，進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA。使用ABI QS5實時熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR（每個樣品設置3個復孔），反應條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，循 環(huán)40次；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s；4℃保存。采用2-ΔΔCT相對定量法比較各濃度藥物實驗組和對照組mRNA的表達差異。引物序列見表1，內(nèi)參為cyclin。

表1 基因及引物序列

1.2.2 MTT法測定細胞存活率將細胞接種至96孔板（2×103個/孔），在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜至細胞完全貼壁，吸棄培養(yǎng)基，設置空白組、對照組和實驗組（每組5個復孔），按濃度梯度加入配制好的藥液，放入培養(yǎng)箱，分別孵育24、48、72 h后取出，按20 μL/孔加入0.5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔中液體，按150 μL/孔加入DMSO，低速振蕩10 min后用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔的OD值。細胞存活率=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.3 克隆形成實驗將HepG2細胞均勻接種至6孔板（200個/孔），孵育過夜待細胞完全貼壁，吸棄培養(yǎng)基，分別使用含0.2%DMSO完全培養(yǎng)基（對照組）、15 μmol/L姜黃素、10 μmol/L鵝去氧膽酸、15 μmol/L姜黃素+10 μmol/L鵝去氧膽酸處理48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10 d。用4%的多聚甲醛固定和結晶紫染色，計算克隆成團的細胞群。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P≤0.05表示差異具統(tǒng)計學意義。每組實驗均設置至少3個平行樣本，每個實驗重復3次以上。

2 結果

2.1 鵝去氧膽酸對HepG2細胞膽汁酸靶基因的mRNA表達影響

隨著鵝去氧膽酸濃度的提高，BSEP和SHP基因的mRNA表達逐步升高，而CYP7A1、CYP8B1、NTCP和β-catenin基因的mRNA則降低（P值均≤0.05），然而FXR基因mRNA表達量在不同藥物濃度的影響下無明顯差異變化（P＞0.05）。鵝去氧膽酸可能通過激活核受體FXR而調(diào)節(jié)關聯(lián)基因BSEP、SHP、CYP7A1、CYP8B1、NTCP和β-catenin的表達。見圖1。

圖1 鵝去氧膽酸對HepG2細胞膽汁酸靶基因的mRNA表達影響

2.2 姜黃素和鵝去氧膽酸對肝癌細胞存活率的影響

按濃度從低到高分別單獨使用姜黃素和鵝去氧膽酸處理HepG2細胞24、48、72 h，用MTT法檢測細胞存活率。姜黃素組和鵝去氧膽酸組細胞存活率都隨劑量的加大和時間的推移有明顯的下降（P≤0.05）。提示姜黃素可以抑制細胞HepG2增殖；鵝去氧膽酸激活FXR后同樣抑制了HepG2細胞的增殖。采用10 μmol/L的鵝去氧膽酸激活細胞FXR后再用各濃度姜黃素處理HepG2細胞，細胞存活率均較兩者單獨使用更低，差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05）。見圖2。

圖2 姜黃素和鵝去氧膽酸對HepG2細胞存活率的影響

姜黃素組和鵝去氧膽酸組與對照組比較都隨劑量的加大和時間的推移有明顯的下降（P≤0.05），提示姜黃素可以抑制SMMC-7721增殖，鵝去氧膽酸激活FXR后同樣抑制了SMMC-7721細胞的增殖。采用10 μmol/L的鵝去氧膽酸激活細胞FXR后再用各濃度姜黃素處理SMMC-7721細胞，細胞存活率均較兩者單獨使用更低（P≤0.05）。見圖3。

圖3 姜黃素和鵝去氧膽酸對SMMC-7721細胞存活率的影響

2.3 克隆形成實驗

單獨使用10 μmol/L的鵝去氧膽酸、15 μmol/L的姜黃素處理肝癌HepG2細胞后，與對照組相比，其克隆形成率分別為（46.4±2.3）%、（53.2±1.9）%，表明鵝去氧膽酸和姜黃素對HepG2增殖均有一定程度的抑制作用。當鵝去氧膽酸和姜黃素聯(lián)用后，其克隆形成率降至（10.2±1.6）%，提示鵝去氧膽酸和姜黃素聯(lián)用對抑制HepG2的增殖有疊加效應。見圖4。

圖4 鵝去氧膽酸和姜黃素處理后HepG2細胞的克隆形成結果

3 討論

肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展是受多基因和多因素調(diào)控的過程。FXR在肝臟、腎臟、腸道和血管內(nèi)皮等器官組織中高水平表達，可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)FXR有顯著的抗腫瘤作用[7]。膽汁酸是膽固醇代謝的終產(chǎn)物，如發(fā)生異常導致水平升高，除產(chǎn)生細胞毒性作用外，還有可能活化特定的膽汁酸受體，影響肝細胞癌發(fā)生和發(fā)展[8]。鵝去氧膽酸是FXR的高效內(nèi)源性配體，有很高的激動活性，F(xiàn)XR通過激活膽汁酸代謝基因從而直接或間接調(diào)控這種基因的表達。膽汁酸的合成與代謝受機體內(nèi)多種反饋機制調(diào)節(jié)，膽汁酸的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)對機體至關重要[9]。本研究通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸可能通過激活HepG2肝癌細胞中的FXR后，上調(diào)膽汁酸代謝的靶基因SHP和BSEP的表達，使影響膽汁酸合成的CYP7A1和CYP8B1的mRNA表達水平降低，并抑制NTCP和β-catenin的mRNA表達。此外，肝細胞內(nèi)鵝去氧膽酸水平上升也可能引起一系列反饋調(diào)節(jié)。機體內(nèi)參與膽汁酸代謝的靶基因較多，部分相關靶基因仍有待發(fā)現(xiàn)，具體通路機制也有待進一步探討。近年來發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路對肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展和預后有重要的作用[10]。有國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)肝癌組織中β-catenin的表達最高，而在正常肝組織卻最低。特異性對β-catenin進行干擾，使其表達降低，可以抑制腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞的凋亡[11]。FXR還可以代償性促進肝再生，敲除FXR基因的小鼠會發(fā)生肝細胞癌[12]。本研究提示鵝去氧膽酸激活FXR以調(diào)控各路膽汁酸關聯(lián)基因，可能成為預防治療肝細胞癌的靶點，并可能與下調(diào)β-catenin基因的表達有關。近年來對化療藥物抗腫瘤作用減毒增效的探求，使姜黃素的研究成為一個重要的研究領域[13]。但姜黃素的抗癌作用機制復雜，姜黃素對各種癌細胞的敏感程度不同，抑制能力不同，抑制癌細胞的作用機制也可能不同[14-15]。

本研究通過MTT實驗檢驗鵝去氧膽酸和姜黃素對人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的毒性作用，并通過克隆形成實驗進一步驗證鵝去氧膽酸和姜黃素對HepG-2和SMMC-7721細胞增殖的影響。結果表明，姜黃素和鵝去氧膽酸對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721均有細胞毒性。兩者均能呈劑量和時間依賴性地抑制HepG2和SMMC-7721細胞的增殖，細胞的存活率隨藥物濃度加大和用藥時間的增加而下降，且聯(lián)用的效果加強。提示鵝去氧膽酸聯(lián)合姜黃素有抗肝細胞癌的應用前景。綜上所述，鵝去氧膽酸對肝癌細胞HepG2的細胞毒性與膽汁酸代謝有關，鵝去氧膽酸聯(lián)合姜黃素能更好地抑制肝癌細胞增殖。